胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901-DDP的建立及三苯氧胺逆轉(zhuǎn)其耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、目的：1．建立順鉑誘導(dǎo)的胃癌多藥耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP，為研究其多藥耐藥的生物學(xué)特性提供細(xì)胞模型；2．初步探討雌激素受體拮抗劑三苯氧胺(TAM)對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP的耐藥逆轉(zhuǎn)機(jī)制。
　　 研究?jī)?nèi)容和結(jié)果：采用逐步遞增順鉑濃度持續(xù)作用的方法誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC7901耐藥，培養(yǎng)耐順鉑的胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP。應(yīng)用倒置顯微鏡觀察耐藥株SGC-7901/DDP生物學(xué)特征的變化，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制

2、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，計(jì)算耐藥細(xì)胞株的群體倍增時(shí)間。CCK-8法測(cè)定SGC7901/DDP細(xì)胞的耐藥指數(shù)及交叉耐藥性。熒光定量PCR檢測(cè)SGC7901/DDP細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞耐藥相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：采用逐步遞增DDP藥物濃度方法誘導(dǎo)以后，SGC-7901/DDP細(xì)胞較SGC-7901細(xì)胞胞體略增大，細(xì)胞核增大，形狀更為不規(guī)則，并可見(jiàn)散在的多核瘤巨細(xì)胞，SGC-7901/DDP，其對(duì)順鉑的耐藥指數(shù)為9.86倍，且此細(xì)胞對(duì)臨床常用化療

3、代表藥物鹽酸阿霉素(ADM)氟尿嘧啶(5-Fu)也分別具有2.51和5.69倍的交叉耐藥性，同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞分析細(xì)胞周期分布和細(xì)胞內(nèi)羅丹明123濃度；結(jié)果表明：與親本細(xì)胞相比，SGC-7901/DDP細(xì)胞S期細(xì)胞減少，而G1、G2期細(xì)胞增多，耐藥細(xì)胞蓄積羅丹明123的能力較親本細(xì)胞明顯下降，穩(wěn)定三個(gè)月后其耐藥特性不變，因此成功建立了生物學(xué)性狀穩(wěn)定的人胃癌耐藥細(xì)胞株SGC-7901/DDP，該細(xì)胞株的建立為深入研究人低分化胃腺癌多藥耐藥發(fā)

4、生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 二．耐藥胃癌細(xì)胞多藥耐藥機(jī)制的研究
　　 為探討胃癌細(xì)胞SGC-7901/DDP多藥耐藥的機(jī)制，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RealtimeQuantitativePCR)檢測(cè)了耐藥相關(guān)基因及凋亡相關(guān)基因的的mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SGC-7901/DDP細(xì)胞MDR-1、MRP-1、MRP-2、MRP-3、MRP-5、ERCC1，Survivin表達(dá)較SGC-7901升高；SGC-7901/DDP

5、細(xì)胞的凋亡相關(guān)基因Bax、Caspase-3表達(dá)明顯下降，Bcl-2表達(dá)顯著升高。Western-blot檢測(cè)耐藥相關(guān)蛋白P-gp和survivin的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SGC-7901/DDP細(xì)胞內(nèi)P-gp和Survivin的表達(dá)較SGC-7901細(xì)胞顯著上調(diào)，這些結(jié)果提示了MDR-1、MRP-1、MRP-2、MRP-3、MRP-5、ERCC1、Survivin、Bax、Caspase-3、Bcl-2參與了胃癌細(xì)胞SGC-7901/DDP多

6、藥耐藥性的形成，提示多種耐藥機(jī)制參與了DDP引起的胃癌細(xì)胞耐藥。
　　 三.雌激素拮抗劑三苯氧胺對(duì)SGC-7901/DDP耐藥逆轉(zhuǎn)作用的研究
　　 為研究三苯氧胺(TAM)可否逆轉(zhuǎn)SGC-7901/DDP細(xì)胞的多藥耐藥性，用CCK-8法觀察不同濃度的TAM對(duì)SGC-7901和SGC-7901/DDP細(xì)胞增殖的影響，以及TAM對(duì)SGC-7901/DDP細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，發(fā)現(xiàn)TAM能夠有效逆轉(zhuǎn)SGC-7901/DDP的多藥

7、耐藥。應(yīng)用流式細(xì)胞儀器檢測(cè)TAM作用SGC-7901/DDP細(xì)胞前后細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的蓄積濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TAM作用于SGC-7901/DDP后，細(xì)胞內(nèi)積累羅丹明123的能力顯著提高，表明TAM可減少藥物的外排逆轉(zhuǎn)SGC-7901/DDP多藥耐藥性。
　　 四.為了解TAM逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞SGC-7901/DDP多藥耐藥性的機(jī)制，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RealtimeQuantitativePCR)檢測(cè)了耐藥相關(guān)基因的mRN

8、A表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)TAM作用SGC-7901/DDP后MDR-1、MRP-1、MRP-2、MRP-3、MRP-5、ERCC1、Survivin表達(dá)較未作用組降低。檢測(cè)了凋亡相關(guān)基因的mRNA的表達(dá)，經(jīng)TAM處理SGC-7901/DDP后：Bax、Caspase-3表達(dá)明顯升高，Bcl-2表達(dá)顯著下降。Western-blot檢測(cè)耐藥及凋亡相關(guān)蛋白P-gp和survivin的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)TAM作用后SGC-7901/DDP細(xì)胞P-g

9、p和survivin表達(dá)下降。這些結(jié)果提示了三苯氧胺可通過(guò)調(diào)節(jié)這些基因或蛋白的變化來(lái)逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞的多藥耐藥。因此對(duì)這些分子的研究有助于揭示胃癌細(xì)胞多藥耐藥的機(jī)制，可為研發(fā)與這些基因或蛋白的相關(guān)的藥物提供依據(jù)。
　　 結(jié)論：1．通過(guò)逐步遞增順鉑濃度持續(xù)誘導(dǎo)的方法建立了順鉑耐藥胃癌細(xì)胞株SGC7901/DDP。
　　 2．SGC7901/DDP細(xì)胞株具有多藥耐藥特征，其耐藥機(jī)制與群體倍增時(shí)間延長(zhǎng)及多藥耐藥基因MDR-1、MR

10、P-1、MRP-2、MRP-3、MRP-5、ERCC1、Survivin表達(dá)上調(diào)有關(guān)。P-糖蛋白、凋亡抑制蛋白Survivin可能參與其耐藥機(jī)制的形成。
　　 3．雌激素拮抗劑三苯氧胺對(duì)耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用，其逆轉(zhuǎn)機(jī)制與上調(diào)促凋亡基因Bax、Caspase-3表達(dá)，下調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2、Survivin和耐藥相關(guān)基因MDR-1、MRP1、MRP-2、MRP-3、MRP-5、ERCC1表達(dá)及下調(diào)P-