胃癌耐藥細胞株SGC7901-DDP的建立及三苯氧胺逆轉(zhuǎn)其耐藥的機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:1.建立順鉑誘導(dǎo)的胃癌多藥耐藥細胞株SGC7901/DDP,為研究其多藥耐藥的生物學(xué)特性提供細胞模型;2.初步探討雌激素受體拮抗劑三苯氧胺(TAM)對胃癌耐藥細胞株SGC7901/DDP的耐藥逆轉(zhuǎn)機制。
   研究內(nèi)容和結(jié)果:采用逐步遞增順鉑濃度持續(xù)作用的方法誘導(dǎo)胃癌細胞SGC7901耐藥,培養(yǎng)耐順鉑的胃癌耐藥細胞株SGC7901/DDP。應(yīng)用倒置顯微鏡觀察耐藥株SGC-7901/DDP生物學(xué)特征的變化,通過細胞計數(shù)法繪制

2、細胞生長曲線,計算耐藥細胞株的群體倍增時間。CCK-8法測定SGC7901/DDP細胞的耐藥指數(shù)及交叉耐藥性。熒光定量PCR檢測SGC7901/DDP細胞和SGC7901細胞耐藥相關(guān)基因的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn):采用逐步遞增DDP藥物濃度方法誘導(dǎo)以后,SGC-7901/DDP細胞較SGC-7901細胞胞體略增大,細胞核增大,形狀更為不規(guī)則,并可見散在的多核瘤巨細胞,SGC-7901/DDP,其對順鉑的耐藥指數(shù)為9.86倍,且此細胞對臨床常用化療

3、代表藥物鹽酸阿霉素(ADM)氟尿嘧啶(5-Fu)也分別具有2.51和5.69倍的交叉耐藥性,同時應(yīng)用流式細胞分析細胞周期分布和細胞內(nèi)羅丹明123濃度;結(jié)果表明:與親本細胞相比,SGC-7901/DDP細胞S期細胞減少,而G1、G2期細胞增多,耐藥細胞蓄積羅丹明123的能力較親本細胞明顯下降,穩(wěn)定三個月后其耐藥特性不變,因此成功建立了生物學(xué)性狀穩(wěn)定的人胃癌耐藥細胞株SGC-7901/DDP,該細胞株的建立為深入研究人低分化胃腺癌多藥耐藥發(fā)

4、生機制奠定了基礎(chǔ)。
   二.耐藥胃癌細胞多藥耐藥機制的研究
   為探討胃癌細胞SGC-7901/DDP多藥耐藥的機制,我們采用實時熒光定量PCR(RealtimeQuantitativePCR)檢測了耐藥相關(guān)基因及凋亡相關(guān)基因的的mRNA表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SGC-7901/DDP細胞MDR-1、MRP-1、MRP-2、MRP-3、MRP-5、ERCC1,Survivin表達較SGC-7901升高;SGC-7901/DDP

5、細胞的凋亡相關(guān)基因Bax、Caspase-3表達明顯下降,Bcl-2表達顯著升高。Western-blot檢測耐藥相關(guān)蛋白P-gp和survivin的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SGC-7901/DDP細胞內(nèi)P-gp和Survivin的表達較SGC-7901細胞顯著上調(diào),這些結(jié)果提示了MDR-1、MRP-1、MRP-2、MRP-3、MRP-5、ERCC1、Survivin、Bax、Caspase-3、Bcl-2參與了胃癌細胞SGC-7901/DDP多

6、藥耐藥性的形成,提示多種耐藥機制參與了DDP引起的胃癌細胞耐藥。
   三.雌激素拮抗劑三苯氧胺對SGC-7901/DDP耐藥逆轉(zhuǎn)作用的研究
   為研究三苯氧胺(TAM)可否逆轉(zhuǎn)SGC-7901/DDP細胞的多藥耐藥性,用CCK-8法觀察不同濃度的TAM對SGC-7901和SGC-7901/DDP細胞增殖的影響,以及TAM對SGC-7901/DDP細胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用,發(fā)現(xiàn)TAM能夠有效逆轉(zhuǎn)SGC-7901/DDP的多藥

7、耐藥。應(yīng)用流式細胞儀器檢測TAM作用SGC-7901/DDP細胞前后細胞內(nèi)羅丹明123的蓄積濃度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TAM作用于SGC-7901/DDP后,細胞內(nèi)積累羅丹明123的能力顯著提高,表明TAM可減少藥物的外排逆轉(zhuǎn)SGC-7901/DDP多藥耐藥性。
   四.為了解TAM逆轉(zhuǎn)胃癌細胞SGC-7901/DDP多藥耐藥性的機制,我們采用實時熒光定量PCR(RealtimeQuantitativePCR)檢測了耐藥相關(guān)基因的mRN

8、A表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn):經(jīng)TAM作用SGC-7901/DDP后MDR-1、MRP-1、MRP-2、MRP-3、MRP-5、ERCC1、Survivin表達較未作用組降低。檢測了凋亡相關(guān)基因的mRNA的表達,經(jīng)TAM處理SGC-7901/DDP后:Bax、Caspase-3表達明顯升高,Bcl-2表達顯著下降。Western-blot檢測耐藥及凋亡相關(guān)蛋白P-gp和survivin的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)TAM作用后SGC-7901/DDP細胞P-g

9、p和survivin表達下降。這些結(jié)果提示了三苯氧胺可通過調(diào)節(jié)這些基因或蛋白的變化來逆轉(zhuǎn)胃癌細胞的多藥耐藥。因此對這些分子的研究有助于揭示胃癌細胞多藥耐藥的機制,可為研發(fā)與這些基因或蛋白的相關(guān)的藥物提供依據(jù)。
   結(jié)論:1.通過逐步遞增順鉑濃度持續(xù)誘導(dǎo)的方法建立了順鉑耐藥胃癌細胞株SGC7901/DDP。
   2.SGC7901/DDP細胞株具有多藥耐藥特征,其耐藥機制與群體倍增時間延長及多藥耐藥基因MDR-1、MR

10、P-1、MRP-2、MRP-3、MRP-5、ERCC1、Survivin表達上調(diào)有關(guān)。P-糖蛋白、凋亡抑制蛋白Survivin可能參與其耐藥機制的形成。
   3.雌激素拮抗劑三苯氧胺對耐藥細胞SGC7901/DDP具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用,其逆轉(zhuǎn)機制與上調(diào)促凋亡基因Bax、Caspase-3表達,下調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2、Survivin和耐藥相關(guān)基因MDR-1、MRP1、MRP-2、MRP-3、MRP-5、ERCC1表達及下調(diào)P-

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