腺樣囊性癌耐藥細(xì)胞株ACC-M-DDP的建立及其多藥耐藥機(jī)制研究.pdf

1、第一部分人腺樣囊性癌耐藥細(xì)胞株ACC-M/DDP的誘導(dǎo)建立 目的：針對目前頭頸部腫瘤在化療中產(chǎn)生的耐藥性問題，建立人腺樣囊性癌耐藥細(xì)胞株ACC-M/DDP并研究其生物學(xué)特性，為腺樣囊性癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。 方法：以腺樣囊性癌細(xì)胞株ACC-M為誘導(dǎo)對象，順鉑為誘導(dǎo)藥物，采用大劑量沖擊和逐漸增加劑量相結(jié)合的方法建立了在1μg/ml順鉑作用下生長良好的耐藥細(xì)胞株ACC-M/DDP；MTT法檢測ACC-M/DDP細(xì)胞及親代

2、細(xì)胞對不同化療藥物敏感性，細(xì)胞計數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期。 結(jié)果：成功誘導(dǎo)建立了人腺樣囊性癌多藥耐藥細(xì)胞株ACC-M/DDP；MTT藥物敏感性檢測結(jié)果表明其對CDDP、Taxol、5-FU和CTX有不同程度的耐受性，其耐藥指數(shù)分別為7.26、3.32、4.18和4.82。細(xì)胞計數(shù)法顯示ACC-M和ACC-M/DDP細(xì)胞的倍增時間分別為21.3和28.7小時，流式細(xì)胞儀顯示耐藥細(xì)胞ACC-M/DDP與ACC-M

3、相比S期明顯增多(P＜0.05)。 結(jié)論：所獲得的耐藥細(xì)胞株ACC-M/DDP細(xì)胞性狀穩(wěn)定，是可靠的人腺樣囊性癌多藥耐藥細(xì)胞模型，與親本細(xì)胞ACC-M相比生物學(xué)特性有明顯差異?？捎糜谙贅幽倚园┒嗨幠退帣C(jī)制的研究。 第二部分 MDR1基因在人腺樣囊性癌多藥耐藥細(xì)胞株ACC-M/DDP中的表達(dá)及臨床意義 目的：探討MDR1基因在人腺樣囊性癌多藥耐藥細(xì)胞株ACC-M/DDP中的表達(dá)及臨床意義，為研究腫瘤的多藥耐藥性及其

4、逆轉(zhuǎn)劑提供理論依據(jù)。 方法：流式細(xì)胞術(shù)測定熒光藥物羅丹明123在ACC-M和ACC-M/DDP細(xì)胞中的蓄積，RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)MDR1 mRNA的表達(dá)，建立裸鼠腮腺移植瘤模型，免疫組化法檢測移植瘤模型中P-gp表達(dá)情況。 結(jié)果：羅丹明123結(jié)果顯示耐藥細(xì)胞ACC-M/DDP和親本細(xì)胞ACC-M細(xì)胞內(nèi)相對熒光強(qiáng)度分別為1.4±0.2和38.9±0.4(P<0.01)，RT-PCR結(jié)果顯示MDR1基因在ACC-M細(xì)胞不表

5、達(dá)，而在ACC-M/DDP細(xì)胞耐藥細(xì)胞呈高表達(dá)。ACC-M組、ACC-M/DDP細(xì)胞組裸鼠移植瘤出現(xiàn)時間分別為(8.00±1.76)d、(14.17±1.17)d，耐藥組瘤體生長速度緩慢，浸潤性降低。免疫組化結(jié)果P-gp在ACC-M/DDP中強(qiáng)表達(dá)而在ACC-M中未表達(dá)。 結(jié)論：由順鉑誘導(dǎo)篩選的腺樣囊性癌ACC-M/DDP細(xì)胞株產(chǎn)生的多藥耐藥性與MDR1/P-gp表達(dá)密切相關(guān)，其在裸鼠體內(nèi)可以保持穩(wěn)定的耐藥性，但是浸潤性降低。本

6、研究為采用MDR1逆轉(zhuǎn)劑提高腺樣囊性癌化療敏感性提供了理論依據(jù)。 第三部分 Survivin在介導(dǎo)腺樣囊性癌細(xì)胞多藥耐藥性的產(chǎn)生及凋亡過程中的作用 目的：觀察紫杉醇對腺樣囊性癌親本細(xì)胞株ACC-2、肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株ACC-M、順鉑耐藥細(xì)胞株ACC-M/DDP的生物學(xué)作用，檢測在此過程中survlvln表達(dá)的變化，探討紫杉醇對腺樣囊性癌的作用效果及survivin在介導(dǎo)腫瘤耐藥過程中的作用。 方法：流式細(xì)胞儀觀察不同

7、濃度紫杉醇對腺樣囊性癌ACC-2、ACC-M、ACC-M/DDP細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞周期變化，AO/EB熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡，RT-PCR檢測三種細(xì)胞中survivin mRNA的表達(dá)及不同濃度紫杉醇作用于ACC-M/DDP后survivin mRNA的表達(dá)情況，免疫組化觀察裸鼠移植瘤中survivin蛋白表達(dá)。 結(jié)果：流式結(jié)果顯示小劑量紫杉醇2μg/ml即可對腺樣囊性癌三種細(xì)胞株產(chǎn)生不同程度的G2/M阻滯，5μg/ml紫杉醇作用

8、24小時ACC-M/DDP的G2/M期為65.4％±1.1與親本細(xì)胞相比顯著增強(qiáng)(P<0.05)。Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示紫杉醇對ACC-2、ACC-M和ACC-M/DDP均有不同程度的抑制作用，小劑量紫杉醇(2μg/ml)即可對ACC-M/DDP和ACC-M之間產(chǎn)生差別(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示survivin基因在三種細(xì)胞中均有表達(dá)，5μg/ml紫杉醇作用24小時與2μg/ml相比ACC-M/DDP