兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島細(xì)胞分化的研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是一類(lèi)具有多向分化潛能的干細(xì)胞，有望成為未來(lái)細(xì)胞、基因治療、組織工程技術(shù)的理想種子細(xì)胞。本研究目的在于分離純化兔BMSCs，并研究其在體外分化為胰島細(xì)胞的潛能，以便未來(lái)利用該類(lèi)細(xì)胞作為疾病細(xì)胞和基因治療的模型。為此，本試驗(yàn)利用一月齡新西蘭大白兔為研究對(duì)象，較為系統(tǒng)全面地研究了其BMSCs的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、鑒定、形態(tài)學(xué)及體外誘導(dǎo)分化能力，為進(jìn)一步

2、深入研究BMSCs的誘導(dǎo)分化和應(yīng)用打下試驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 1.應(yīng)用全骨髓法分離BMSCs，根據(jù)骨BMSCs在培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)的特點(diǎn)，通過(guò)傳代培養(yǎng)來(lái)純化已分離到的BMSCs，體外培養(yǎng)至第3代，獲得純度較高的BMSCs；對(duì)分離純化的第3代兔BMSCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物鑒定，得出兔BMSCs表面標(biāo)志CD90、CD44陽(yáng)性表達(dá)，CD34陰性，進(jìn)一步證實(shí)了本法所得到的純化細(xì)胞即為兔BMSCs，為進(jìn)一步的試驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。結(jié)

3、論：全骨髓法能夠成功分離得到純度較高的兔BMSCs。
　　 2.采用二甲基亞砜聯(lián)合高濃度葡萄糖對(duì)分離純化的第3代兔BMSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)，觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果試驗(yàn)組在誘導(dǎo)7d出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)樣集落，10d獲得排列緊密的細(xì)胞團(tuán)，而對(duì)照組細(xì)胞始終未見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)；用雙硫腙染色法鑒定細(xì)胞團(tuán)，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組為陽(yáng)性；用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)胰島素的表達(dá)，試驗(yàn)組顯示陽(yáng)性；用ELISA法檢測(cè)分泌到培養(yǎng)液中的胰島素含量，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組7d

4、、10d的胰島素含量分別為(27.82±0.43)mU/L、(27.89±0.25)mU/L，與對(duì)照組的(23.39±0.20)mU/L、(25.71±0.27)mU/L比較，差異極顯著(P<0.01)。結(jié)論：二甲基亞砜聯(lián)合高濃度葡萄糖能夠在較短的周期內(nèi)誘導(dǎo)出胰島細(xì)胞。
　　 3.采用含有10ng/mLbFGF、10ng/mLEGF、2％B27的DMEM/F-12培養(yǎng)液對(duì)BMSCs誘導(dǎo)6d，用含10ng/mLHGF、10ng/m

5、LBTC、10ng/mL活化素A、10mmol/L尼克酰胺、2％B27的H-DMEM培養(yǎng)液對(duì)BMSCs誘導(dǎo)6d，結(jié)果試驗(yàn)組BMSCs細(xì)胞收縮并相互聚集成圓型細(xì)胞團(tuán)，對(duì)照組未見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)；經(jīng)雙硫腙染色，試驗(yàn)組顯示陽(yáng)性，顯示試驗(yàn)組細(xì)胞具備胰島細(xì)胞富含鋅離子的典型特征；經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，試驗(yàn)組結(jié)果為陽(yáng)性，顯示誘導(dǎo)后的BMSCs具備分泌胰島素的能力。結(jié)果顯示經(jīng)本方法所誘導(dǎo)出細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞為胰島細(xì)胞。結(jié)論：應(yīng)用細(xì)胞生長(zhǎng)因子聯(lián)合作用能夠誘導(dǎo)BMSCs分化

6、為胰島細(xì)胞。
　　 4.將分離純化的BNSCs分為7組，分別標(biāo)記為a、b、c、d、e、f、g組，其中a組為對(duì)照組，自始至終用含10％FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；b組先用無(wú)血清、含1％DMSO的DMEM/F-12誘導(dǎo)3d，再用H-DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行刺激培養(yǎng)；c、d、e、f組在b組的基礎(chǔ)上分別在第1、3、7、10d加入10mmol/L的尼克酰胺；g組用只含10mmol幾尼克酰胺的DMEM/V-12培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后