B-ALL細(xì)胞影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:Notch信號(hào)通路相關(guān)配體Jagged1在兒童急性白血病中的表達(dá)特點(diǎn)及意義
　　目的：探討Notch信號(hào)通路相關(guān)配體Jagged1在急性白血病中的表達(dá)特點(diǎn)及臨床意義。
　　方法：收集88例初診兒童急性白血病骨髓液（包括AML25例，B-ALL52例，T-ALL11例），18例ITP患兒骨髓液為對(duì)照組。應(yīng)用Real-Time PCR法檢測(cè)各組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中Jagged1 mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：

2、　　1)Jagged1在AML組、B-ALL組、T-ALL組及對(duì)照組均有表達(dá)；
　　2)AML組Jagged1表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05，n=25）；
　　3）B-ALL組Jagged1表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，n=52）；
　　4）T-ALL組Jagged1表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，n=11）；
　　5）在B-ALL組中，高危組Jagg

3、ed1表達(dá)水平高于在標(biāo)危組與中危組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　結(jié)論：Notch相關(guān)配體Jagged1在不同類型兒童急性白血病中的表達(dá)水平不一致，與對(duì)照組相比，B-ALL中呈高表達(dá)，T-ALL呈低表達(dá)，AML中呈正常表達(dá)，提示在ALL中存在Jagged1的表達(dá)異常。
　　第二部分:B-ALL細(xì)胞影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化及其機(jī)制研究
　　目的：研究B-ALL細(xì)胞對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marr

4、ow mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨分化的影響，并探討Notch信號(hào)通路在此過(guò)程中的作用。
　　方法：采用B-ALL細(xì)胞與BMSCs體外共培養(yǎng)模型模擬體內(nèi)微環(huán)境，以BMSCs單獨(dú)培養(yǎng)及正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)作為對(duì)照。成骨誘導(dǎo)條件下共培養(yǎng)3天后，Real time PCR及Western-blot方法檢測(cè)各組成骨分化標(biāo)志物OPN、OCN、Runx2 mRNA和蛋白表達(dá)差異；成骨誘導(dǎo)條件下

5、共培養(yǎng)14天后，茜素紅S染色檢測(cè)BMSCs的礦化能力，堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）試劑盒檢測(cè)ALP活性。最后通過(guò)重組蛋白Jagged1與中和抗體anti-Jagged1-Ab激活與抑制BMSCs中Notch信號(hào)通路，探討B(tài)-ALL細(xì)胞是否通過(guò)Jagged1激活BMSCs中Notch信號(hào)通路影響B(tài)MSCs向成骨細(xì)胞分化。
　　結(jié)果：
　　1）B-ALL細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)組中，成骨分化標(biāo)志O

6、PN、OCN表達(dá)水平較對(duì)照組降低，同時(shí)ALP活性及礦化能力較對(duì)照組減低；
　　2）B-ALL細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)后，BMSCs中Notch信號(hào)通路下游基因Hes1表達(dá)水平較對(duì)照組上調(diào)，提示BMSCs中的Notch細(xì)胞通路被激活；
　　3）B-ALL細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)體系中加入anti-Jagged1-Ab中和抗體后，Notch信號(hào)通路被抑制，同時(shí)成骨分化標(biāo)志OPN、OCN表達(dá)上調(diào)；
　　4）BMSCs中加入重組蛋

7、白Jagged1能夠激活Notch信號(hào)通路，同時(shí)成骨分化標(biāo)志OPN、OCN表達(dá)下降；
　　5）BMSCs中Notch信號(hào)通路被抑制后，其下游基因Hes1表達(dá)下調(diào)，而成骨分化特異轉(zhuǎn)錄因子Runx2蛋白表達(dá)上調(diào)；
　　結(jié)論：B-ALL細(xì)胞可抑制BMSCs向成骨細(xì)胞分化，其可能的機(jī)制是B-ALL細(xì)胞通過(guò)Jagged1激活BMSCs中的Notch信號(hào)通路，其下游基因Hes1活化降低成骨分化轉(zhuǎn)錄因子Runx2蛋白表達(dá)水平，從而抑制BM

8、SCs向成骨細(xì)胞分化。
　　第三部分:B-ALL細(xì)胞影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化及其機(jī)制研究
　　目的：研究B-ALL對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）內(nèi)皮分化的影響，并探討在此過(guò)程中可能存在的機(jī)制。
　　方法：采用B-ALL細(xì)胞與BMSCs體外共培養(yǎng)模型模擬體內(nèi)微環(huán)境，以BMSCs單獨(dú)培養(yǎng)及正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)作為對(duì)照。共培養(yǎng)三

9、天與七天后，Real time PCR檢測(cè)各組內(nèi)皮分化標(biāo)志物Flk-1、CD31、vWF mRNA表達(dá)差異；Western-blot方法檢測(cè)各組內(nèi)皮分化特異標(biāo)志CD31、Flk-1蛋白表達(dá)差異；再通過(guò)共培養(yǎng)中加入中和抗體anti-Jagged1-Ab抑制BMSCs中Notch信號(hào)通路，驗(yàn)證B-ALL細(xì)胞是否通過(guò)Jagged1激活BMSCs中Notch信號(hào)通路影響B(tài)MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化。最后采用ELISA檢測(cè)各組培養(yǎng)上清中VEGF分泌蛋

10、白表達(dá)水平，探討B(tài)-ALL細(xì)胞影響B(tài)MSCs向內(nèi)皮分化的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1）B-ALL細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)三天后，BMSCs內(nèi)皮分化標(biāo)志Flk-1、CD31、vWF mRNA表達(dá)水平及Flk-1、CD31蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組升高，但無(wú)顯著差異(P>0.05)；
　　2）B-ALL細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)七天后，BMSCs內(nèi)皮分化標(biāo)志Flk-1、CD31、vWF mRNA表達(dá)水平及Flk-1、CD31蛋白表達(dá)水平

11、較對(duì)照組升高，有顯著差異（P<0.05）；
　　3）B-ALL細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)后，Notch信號(hào)通路被激活；
　　4）共培養(yǎng)組中加入anti-Jagged1-Ab中和抗體后，Notch信號(hào)通路被抑制，但Flk-1、CD31、vWF mRNA表達(dá)水平及Flk-1、CD31蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯改變；
　　5）采用ELISA檢測(cè)共培養(yǎng)組中VEGF分泌蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組中VEGF表達(dá)水平上調(diào)，同時(shí)B-ALL細(xì)胞與B