人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 本實(shí)驗(yàn)旨在探討人骨髓MSCs(hMSCs)的分離、純化、體外擴(kuò)增以及向軟骨細(xì)胞分化的條件。使用特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，用半定量RT-PCR的方法檢測(cè)其是否表達(dá)Ⅱ型膠原，探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外向軟骨細(xì)胞分化的可能性，為MSCs應(yīng)用于軟骨組織工程，修復(fù)損傷的軟骨組織提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。 方法 無(wú)菌條件下臨床采集無(wú)血液系統(tǒng)疾病和家族遺傳史的28-65歲成人骨髓8例，用含1O％

2、FBS的DMEM培養(yǎng)液5倍稀釋，2000rpm離心5min，棄上清及脂肪層，加入5ml含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液。將其接種于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液(低糖DMEM，含10％FBS，100u/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)中，置于37℃、5％C0<,2>飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。3天后更換培養(yǎng)液，小心棄去未貼壁細(xì)胞。以后每3天換液一次。待細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿瓶底80％時(shí)，用0.25％的胰蛋白酶消化傳代，再以(6-8)×10<'3>/

3、cm<'2>的密度接種傳代培養(yǎng)：去除培養(yǎng)液，PBS沖洗1次，用0.25％的胰蛋白酶置37℃、5％C0<,2>飽和濕度的孵箱內(nèi)消化3-5分鐘，見細(xì)胞松動(dòng)浮起時(shí)，F(xiàn)BS終止消化，1500rpm離心5分鐘，棄上清，加入含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于25cm<'2>培養(yǎng)瓶中，3ml/瓶，置于37℃、5％C0<,2>和飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每3天換液1次。取第取擴(kuò)增至第3代的hMSCs以5×10<'4>/ml的密度接種于預(yù)先

4、放置有消毒處理好的蓋玻片的6孔板內(nèi)。細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分2組。實(shí)驗(yàn)組每孔加入2ml無(wú)血清低糖DMEM培養(yǎng)液，內(nèi)含2mg/L胰島素、3mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、1mmo1/L丙酮酸、100nmo1/L地塞米松和10μg/LTGF-β<,1>。對(duì)照組每孔加入2ml低糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液。每組加3孔。細(xì)胞在37℃、5％C0<,2>和飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每3-4天換液1次。分別在誘導(dǎo)后的7天、14天取出玻片，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)分析，與及

5、MSCs誘導(dǎo)分化的軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)的檢測(cè)。 結(jié)果 原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞接種24小時(shí)后即有少量圓形細(xì)胞貼壁，48小時(shí)后貼壁細(xì)胞增多。72小時(shí)后已出現(xiàn)數(shù)個(gè)細(xì)胞集落，每個(gè)集落約由幾個(gè)到幾十個(gè)細(xì)胞組成，此時(shí)培養(yǎng)液中仍有許多懸浮細(xì)胞。經(jīng)過2-3次換液后，懸浮細(xì)胞多已被去除，貼壁變形的細(xì)胞增多，有的細(xì)胞已伸長(zhǎng)形成長(zhǎng)梭形或多角形，呈成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，胞漿內(nèi)有細(xì)胞小顆粒，核大、圓形或橢圓形。培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞集落逐漸增多，增大，1

6、2-14天時(shí)集落逐漸相互融合。傳代培養(yǎng)后細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯加快，經(jīng)歷24-48小時(shí)后的緩滯期后迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，10-15天鋪滿瓶底。誘導(dǎo)7天及14天后骨髓MSCs蕃紅花-O染色陽(yáng)性，而對(duì)照組細(xì)胞染色陰性。表明經(jīng)誘導(dǎo)后的骨髓MSCs有粘多糖的分泌。經(jīng)半定量RT-PCR檢測(cè)，誘導(dǎo)7天和14天的骨髓MSCs表達(dá)COL2A1 mRNA，對(duì)照組未見表達(dá)。表明經(jīng)誘導(dǎo)后的骨髓MSCs有軟骨細(xì)胞特異性Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)。 結(jié)論