人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:建立一種體外分離和培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrowderived Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)的方法;探討B(tài)MSCs在單層培養(yǎng)中向軟骨細(xì)胞定向分化的條件,為軟骨組織工程提供種子細(xì)胞.方法:分別采集3例志愿者骨髓各6ml,用Percoll細(xì)胞分離液分離,收集單個(gè)核細(xì)胞,在含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)擴(kuò)增,流式細(xì)胞儀分析BMSCs的表面標(biāo)志.將培養(yǎng)第3代細(xì)胞分為4組:A組為對(duì)照

2、組,B組為無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基組(含10ng/ml的rhTGF-β<,1>、丙酮酸鈉1mM、地塞米松10<'-7>M、牛胰島素6.25μg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6.25μg/ml的高糖DMEM培養(yǎng)液);C組為含5％胎牛血清的誘導(dǎo)培養(yǎng)基組;D組為含10％胎牛血清的誘導(dǎo)培養(yǎng)基組.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,免疫組化檢測(cè)Ⅱ型膠原分泌,原位雜交檢測(cè)Ⅱ型膠原mRNA表達(dá),甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)蛋白多糖的分泌,<'3>H標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷(<'3>H-TdR

3、)摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況.結(jié)果:經(jīng)密度梯度離心后,活細(xì)胞比例在96％以上.貼壁后的細(xì)胞形態(tài)均一,由梭形向多角形轉(zhuǎn)變,并一致表達(dá)CD9,而CD34、CD38、CD45、CD61呈陰性.B、C組細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后Ⅱ型膠原免疫組化均為陽(yáng)性,原位雜交可檢測(cè)到Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá),甲苯胺藍(lán)染色陽(yáng)性,而A、D兩組分別為陰性和弱陽(yáng)性.D組細(xì)胞增殖最強(qiáng),而B組細(xì)胞最弱,四組細(xì)胞3H-TdR攝入量的大小順序?yàn)镈>C>A>B.結(jié)論:密度梯度離心法是