ELISA-雙酶底物循環(huán)法的建立及定量檢測腦脊液tau、p-tau和NF含量的研究.pdf

1、同濟醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文ELISA雙酶底物循環(huán)法的建立及定量檢測腦脊液tau、ptau和NF含量的研究姓名：胡元元申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生物化學(xué)指導(dǎo)教師：屈伸何善述2000.5.1絲些絲堂絲墼蓮重量鱉長分別為560rim和590nm；在此條件下resorufin的線性范圍為10nm0125umol。(3)雙酶循環(huán)熒光底物resazurin對產(chǎn)物resorufin有不同程度淬滅作用，當(dāng)?shù)孜餄舛纫?umol時，底物對產(chǎn)物的淬滅不明顯，且本

2、底較低。在此底物濃度下對乙醇脫氫酶(ADH)和黃傳酶(diaphorase，Dia)者不同濃度配對的雙酶循環(huán)效率進行了比較，結(jié)果ADH與Dia在O5u／00125u配對時，其線性范圍較大且靈敏度達到實驗要求，可以測量01～100nmol的NAD。(4)在堿性磷酸酶(ALP)催化NADP生成NAD的起始反應(yīng)中，反應(yīng)體系中Zn“、M92和DEA緩沖液均可影響ALP活性，在無Zn“、M92濃度為O04mM、DEA緩沖液濃度為O225M時，AL

3、P顯示最大活性。(5)不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間也影響ALP活性，在30℃、45分鐘為ALP的最適反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間。(6)起始反應(yīng)底物NADP存放在4“C48小時后99152％發(fā)生自發(fā)水解；而在室溫條件下(25℃、30℃)，6小時有58，77％的自發(fā)水解：當(dāng)NADP存放在20℃時重復(fù)凍溶10次，無明顯自發(fā)水解現(xiàn)象。(7)底物NADP的不同濃度亦會影響ALP催化的反應(yīng)速度，當(dāng)‘NADP濃度為lumol時，ALP線性范圍寬，且本底低。(8)雙

4、酶循環(huán)擴增法可檢測110一“illoles的ALP。(9)實驗中檢驗了ELISA中各種試劑問的交叉反應(yīng)，結(jié)果顯示多克隆抗體(92e)與單克隆抗體(tau一1，PHF1)，92e與二抗Jackson—ALP，及單克隆抗體tau一1與PHF一1之間均無交叉反應(yīng)發(fā)生。結(jié)論本實驗研究建立的ELISA一雙酶底物循環(huán)法具有下列特點：①該法靈敏度比常規(guī)ELISA增高1000倍左右，，可特異性測量樣品中低至1pg的微量抗原或抗體成份。②對反應(yīng)體系的離子