定量檢測(cè)人超敏C-反應(yīng)蛋白雙抗體夾心ELISA方法的建立及初步臨床應(yīng)用.pdf

1、背景： C—反應(yīng)蛋白(CRP)是一種高度保守的血漿蛋白，在脊椎動(dòng)物和多種非脊椎動(dòng)物中存在同系物，參與全身炎癥反應(yīng)。機(jī)體處于炎癥狀態(tài)時(shí)，其血漿CRP濃度升高，因此CRP作為炎癥標(biāo)記物被廣泛應(yīng)用于臨床。CRP是一種模式識(shí)別分子，通常與死亡細(xì)胞或病原體表面的特殊分子構(gòu)型結(jié)合。在組織損傷或感染后數(shù)小時(shí)內(nèi)，其合成迅速增加，提示CRP參與機(jī)體的宿主防御和固有免疫反應(yīng)。最近，血漿CRP水平的輕微升高和未來(lái)心血管事件的相關(guān)性被廣泛證實(shí)。因此，建

2、立高靈敏度的CRP測(cè)定方法是一項(xiàng)重要的實(shí)用性研究領(lǐng)域，引起研究工作者和臨床醫(yī)生的興趣和關(guān)注。 目的： 初步建立一種可用于檢測(cè)人超敏C—反應(yīng)蛋白(hs—CRP)的雙抗體夾心ELISA方法，并初步探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。 方法： 1．采用ProteinA親和層析柱純化本室制備的抗CRP單克隆抗體(mAb)，并行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)和蛋白印跡(Western—blot)對(duì)純化抗體特性進(jìn)行鑒定；利用

3、簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法對(duì)抗CRPmAb進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記。 2．采用dp—AminophenylphosphorylCholnieGel親和層析柱從腫瘤患者胸水中分離、純化CRP，并通過(guò)SDS—PAGE與Western—blot檢測(cè)其純度與特異性。 3．通過(guò)抗體配對(duì)實(shí)驗(yàn)確定最佳配對(duì)抗體，行方陣滴定法確定包被抗體和酶標(biāo)抗體的最適工作濃度；以純化的CRP抗原為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；以重復(fù)性、靈敏性、回收性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)ELIS

4、A方法。 4．對(duì)冠狀動(dòng)脈無(wú)狹窄者(冠脈正常組)68例、狹窄直徑＜50％者(冠狀動(dòng)脈硬化癥組)59例和狹窄直徑≥50％者(冠心病組)67例采用雙抗體夾心ELISA方法測(cè)定血漿hs—CRP水平。 5．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Hs—CRP數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，以中位數(shù)(M)和四分位數(shù)間距(QR)表示。非正態(tài)分布資料多組間比較用Kruskal—Wallis檢驗(yàn)，兩兩比較用Mann—Whitney檢驗(yàn)。

5、 結(jié)果： 1．采用proteinA親和層析柱從小鼠腹水中純化出55KD、25KD各一條帶，SDS—PAGE檢測(cè)純度超過(guò)95％的蛋白，行western—blot檢測(cè)未見(jiàn)雜帶。并行HRP酶標(biāo)，酶標(biāo)抗體行western—blot檢測(cè)未見(jiàn)雜帶。 2．采用dp—AminophenylphosphorylCholnieGel親和層析法從腫瘤患者胸水中成功純化出大小為24KD蛋白，SDS—PAGE檢測(cè)純度超過(guò)95％，用抗CRPmA

6、b進(jìn)行western—blot檢測(cè)未見(jiàn)雜帶。 3．最佳配對(duì)組合為抗CRPmAb1C10和HRP標(biāo)記抗CRPmAb2C11，最適工作濃度分別為10ug/ml和1：2000，該方法的批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為3.1％～9.7％和3.6～13.6％，靈敏度達(dá)8.3ng/ml，回收率為90％～109％。 4．用ELISA法測(cè)定的血漿hs—CRP水平：冠狀動(dòng)脈硬化癥組明顯高于冠脈正常組[(1.15±3.65mg/L)vs(0.74±