NSE單抗的制備及雙抗夾心ELISA檢測方法的建立.pdf

1、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)是烯醇化酶的一種同工酶。目前已發(fā)現(xiàn)5種烯醇化酶的同工酶αα、ββ、γγ、αβ、αγ、γγ、αγ組成的同工酶為神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞所特有,故命名為神經(jīng)元特異性烯醇化酶。當(dāng)缺血、缺氧、中毒或損傷時(shí),細(xì)胞膜的完整性受到破壞,NSE便從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。從而進(jìn)入血液循環(huán)。目前NSE已成為小細(xì)胞肺癌及神經(jīng)母細(xì)胞瘤診斷中最敏感的腫瘤標(biāo)志物,它對神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤

2、的診斷、治療及預(yù)防都有很高的臨床價(jià)值。
　　 我們通過基因工程技術(shù)克隆人的神經(jīng)元特異性烯醇化酶,通過工程菌株的表達(dá)來獲得足夠量的NSE融合蛋白,對其純化后,免疫Balb/C小鼠。采用常規(guī)雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合,通過間接ELISA法進(jìn)行篩選,獲得多株可穩(wěn)定分泌NSE單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株。將獲得的陽性雜交瘤進(jìn)行腹水制備并純化,并對抗體的亞型進(jìn)行鑒定,采用ELISA、WB、IP、IF、Ihc等技術(shù)對這些單克隆抗體進(jìn)行分析。免疫

3、印跡結(jié)果顯示,該抗體不僅能識別細(xì)胞內(nèi)源的NSE蛋白還能識別分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的NSE蛋白,此外該抗體還可用于免疫熒光及免疫組化檢測。通過對這些NSE單克隆抗體進(jìn)行的一系列鑒定和效價(jià)檢測,我們從中挑出一株NSE單克隆抗體,用辣根過氧化物酶(HRP)對其進(jìn)行標(biāo)記。采用棋盤滴定實(shí)驗(yàn)建立了雙抗夾心ELISA檢測系統(tǒng),并對雙抗夾心ELISA檢測系統(tǒng)的封閉條件及酶標(biāo)抗體作用時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化,最后確定分別以＃3NSE單克隆抗體為包被抗體,#4NSE