毛白楊PtCaM的克隆及功能分析.pdf

1、木材形成是一個受到基因嚴格調(diào)控的復(fù)雜生物學過程，若通過分子育種技術(shù)來改良木材品質(zhì)，首先需要深入了解木材形成過程的分子機制，即研究控制木材形成的關(guān)鍵基因及其相互作用機制，以實現(xiàn)有目的地進行分子育種設(shè)計，最終達到調(diào)控木材形成、改良木材品質(zhì)的目的。鈣調(diào)素（Calmodulin，CaM）是一種分布最為廣泛，功能最為重要的鈣依賴性調(diào)節(jié)蛋白，作為Ca2+的細胞內(nèi)受體影響Ca2+濃度，并通過激活一系列的靶酶和非酶蛋白質(zhì)，調(diào)控由Ca2+引起的一系列生理

2、生化反應(yīng)。PtCaM在毛白楊形成層部位“高豐度表達”，表明PtCaM有可能參與樹木次生生長的調(diào)控過程。為了研究PtCaM與樹木生長和發(fā)育的關(guān)系，本研究克隆得到毛白楊PtCaM，通過基因工程技術(shù)研究其在楊樹中的超表達對形成層活動和次生維管組織發(fā)育的影響。本文的主要研究結(jié)果如下：
　?。?）利用RT-PCR方法，從毛白楊形成層組織制備的cDNA中分離得到PtCaM cDNA，并進行測序和序列分析。分析結(jié)果表明，克隆的PtCaM cDN

3、A片段總長為642bp，基因內(nèi)部含有大小為447bp的完整開放閱讀框架，可編碼長度為149個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)多肽。PtCaM與胡蘿卜、毛果楊、擬南芥、玉米和小麥的CaM高度同源，同源性分別為100％、99%、99%、98%、97%。
　?。?）為了研究PtCaM對形成層活動和次生維管組織形成的影響，構(gòu)建PtCaM超量表達載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化84K楊，獲得轉(zhuǎn)基因植株。實時熒光定量PCR檢測表明，PtCaM在轉(zhuǎn)基因植株中超量表達

4、，最高約為對照植株的11.9倍。通過表型觀察和方差分析發(fā)現(xiàn) PtCaM正義轉(zhuǎn)基因植株苗高平均比對照植株高9cm，地徑平均比對照植株大0.59cm，成熟葉的形態(tài)與對照植株相比發(fā)生明顯變化，且均差異極顯著。對楊樹莖橫切面進行切片觀察發(fā)現(xiàn)，PtCaM正義轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)部區(qū)域的細胞層數(shù)明顯增多，但細胞體積基本沒有變化。此外韌皮部和形成層區(qū)域的細胞層數(shù)也幾乎沒有變化。這些結(jié)果說明PtCaM的超量表達導(dǎo)致了形成層細胞的分裂從而對木質(zhì)部區(qū)域的細胞增殖