hsBAFF增強胞內(nèi)鈣離子調(diào)控B淋巴細(xì)胞ERK活性和增殖機理研究.pdf

1、本研究運用細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞儀、激光共聚焦顯微鏡和Western bloting等免疫學(xué)和細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)，選用BAPTA/AM鈣離子鰲合劑靶向耗竭胞內(nèi)鈣離子活性，綜合研究和觀察了hsBAFF誘發(fā)B淋巴細(xì)胞胞內(nèi)游離Ca2+濃度([Ca2+]i)變化及其與B淋巴細(xì)胞ERK1/2活性和增殖的關(guān)系，探討了hsBAFF上調(diào)B淋巴細(xì)胞[Ca2+]i水平的作用和分子機理。結(jié)果如下： 1、hsBAFF對體外培養(yǎng)的脾臟B淋巴細(xì)胞[Ca2+]i

2、的影響 研究hsBAFF對體外培養(yǎng)的鼠脾臟B淋巴細(xì)胞胞內(nèi)游離Ca2+濃度([Ca2+]i)的影響，探討hsBAFF調(diào)控B淋巴細(xì)胞增殖的細(xì)胞學(xué)機制。分離的原代培養(yǎng)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞，分為對照組和3個hsBAFF處理(1.0、2.5和5.0 μg/ml)組。分別在實驗后0h、12 h、24 h，收集細(xì)胞并用單抗B220標(biāo)記以顯示B淋巴細(xì)胞，再以熒光探針Fluo-3/AM負(fù)載，然后通過激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)或流式細(xì)胞儀(fl

3、ow cytometry，F(xiàn)CM)分析B淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強度。結(jié)果顯示，hsBAFF處理組B淋巴細(xì)胞較對照組細(xì)胞形態(tài)好、活力強：[Ca2+]i熒光強度顯著高于對照組，且Ca2+熒光強度的變化發(fā)生在hsBAFF刺激細(xì)胞增殖前。暗示：hsBAFF能夠通過上調(diào)細(xì)胞[Ca2+]i水平活化B淋巴細(xì)胞。 2、hsBAFF增強[Ca2+]i穩(wěn)態(tài)調(diào)控B淋巴細(xì)胞增殖和反應(yīng) 探討hsBAFF增強[Ca2+]i穩(wěn)態(tài)的作用和意義。采用抗C

4、D-19磁珠分離純化B淋巴細(xì)胞。分離的B淋巴細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板，實驗分為對照組(PBS)、標(biāo)準(zhǔn)品hBAFF(2μg/ml)和5個hsBAFF(0.5，1，2，3和5μg/ml)處理組。采用MTT法分析hsBAFF對B淋巴細(xì)胞增殖作用。純化的鼠脾B淋巴細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板，實驗分為對照組、hsBAFF(2.5μg/ml)處理組、Tg(0.5μM)處理組和hsBAFF+Tg處理組，各處理組細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h(37℃，5％CO2)

5、后，采用MTT分析細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，hsBAFF以劑量依賴的方式刺激B淋巴細(xì)胞增殖且明顯高于對照組。2μg/ml的hsBAFF和標(biāo)準(zhǔn)品hBAFF作用B淋巴細(xì)胞效應(yīng)相近。Tg明顯降低B淋巴細(xì)胞存活率，然而，hsBAFF明顯削弱或緩解Tg導(dǎo)致的B淋巴細(xì)胞活力降低。暗示：hsBAFF在增強B淋巴細(xì)胞[Ca2+]i穩(wěn)態(tài)調(diào)控B淋巴細(xì)胞增殖和反應(yīng)中具有重要作用。 3、hsBAFF增強[Ca2+]i調(diào)控B淋巴細(xì)胞ERK1/2活性機理研究

6、 采用抗CD-19磁珠分離B淋巴細(xì)胞；選用BAPTA/AM鈣離子鰲合劑靶向耗竭胞內(nèi)鈣離子活性，以細(xì)胞免疫化學(xué)和Western Blot技術(shù)分析hsBAFF(2.5μg/ml)和BAPTA/AM(20μM)。單一或聯(lián)合作用B淋巴細(xì)胞ERK1/2磷酸化表達(dá)。探討hsBAFF增強[Ca2+]i調(diào)控B淋巴細(xì)胞ERK活性機理。結(jié)果顯示，hsBAFF引起磷酸化ERK1/2水平從4 h開始明顯上升一直持續(xù)到24 h，但當(dāng)BAPTA/AM耗竭h(yuǎn)s