hsBAFF上調(diào)胞內(nèi)鈣離子調(diào)控CD4+T淋巴細(xì)胞增殖和活性機(jī)理研究.pdf

1、本研究運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞分析、放射性免疫分析、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)等免疫學(xué)和細(xì)胞學(xué)技術(shù)，綜合研究和觀察了hsBAFF 對(duì)小鼠T 淋巴細(xì)胞，特別是CD4+T 淋巴細(xì)胞增殖活性及其分泌細(xì)胞因子的變化以及與鈣離子的關(guān)系，選用BAPTA/AM 鈣離子鰲合劑靶向耗竭胞內(nèi)鈣離子活性、Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞毒物Thapsigargin（Tg)，探討了hsBAFF 上調(diào)CD4+T 淋巴細(xì)胞[Ca2+]I 水平與其增殖和生存的關(guān)系。結(jié)果如下:
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2、 hsBAFF 調(diào)控體外培養(yǎng)鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞功能活性研究采用免疫磁珠法獲得純的鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞懸液（3×106/ml）接種到96 孔培養(yǎng)板(0.1 ml/well)，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、anti-CD3（1 μg/ml）組、anti-CD3 不同濃度hsBAFF（0.5、2.5、5.0、10 μg/ml）處理組，每組3個(gè)重復(fù)。采用MTT 法分析hsBAFF 對(duì)T 淋巴細(xì)胞增殖影響。400 μl T 淋巴細(xì)胞懸液接種到24 孔培養(yǎng)板，然后

3、用不同濃度hsBAFF（0、0.5、2 μg/ml）處理細(xì)胞12和24 h 后，分別采用放射免疫分析和ELISA 檢測(cè)上清液中IL-2和INF-γ水平。結(jié)果顯示： hsBAFF 明顯刺激T 淋巴細(xì)胞增殖，且2.5 μg/mlhsBAFF 作用最強(qiáng)；hsBAFF 刺激T 細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IL-2和IFN-γ。提示：hsBAFF在增強(qiáng)T 淋巴細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子分泌中具有重要作用。
　　 2 hsBAFF 調(diào)控體外培養(yǎng)鼠脾臟CD4+

4、T 淋巴細(xì)胞功能活性研究采用免疫磁珠法分離獲得純化小鼠脾臟CD4+T 淋巴細(xì)胞懸液（3×106 /ml），接種到96 或24 孔培養(yǎng)板。細(xì)胞在不同濃度的hsBAFF（0.5、2.5 μg/ml）與有或沒有anti-CD3（1 μg/ml）共刺激作用下，或者分別與IL-2（50、100 U/ml）或IFN-γ（1 ng/ml）共處理12、24 或72 h。采用MTT 法分析CD4+T 淋巴細(xì)胞增殖變化；分別采用放射免疫分析和ELISA 檢

5、測(cè)培養(yǎng)上清液中IL-2和INF-γ水平。結(jié)果顯示：anti-CD3 單獨(dú)或與hsBAFF共刺激均明顯提高CD4+T 淋巴細(xì)胞增殖；hsBAFF 刺激CD4+T 細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IL-2和IFN-γ。IL-2和IFN-γ協(xié)同hsBAFF 調(diào)控CD4+T 淋巴細(xì)胞增殖、并分別明顯促進(jìn)細(xì)胞分泌高水平IFN-γ和IL-2。提示：hsBAFF 增強(qiáng)CD4+T 淋巴細(xì)胞增殖及其細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ分泌，并且后者協(xié)同hsBAFF能更好地調(diào)節(jié)C

6、D4+T 淋巴細(xì)胞功能活性。
　　 3 hsBAFF 上調(diào)[Ca2+]I 穩(wěn)態(tài)調(diào)控CD4+T 淋巴細(xì)胞功能活性探討1）采用免疫磁珠法分離獲得純化小鼠脾臟CD4+T 淋巴細(xì)胞懸液（3×106 /ml），接種到24 孔培養(yǎng)板。細(xì)胞在不同濃度的hsBAFF（0、2.5、.5、10 μg/ml）與有或沒有anti-CD3（1 μg/ml）共刺激作用12 h 后，用熒光探針Fluo-3/AM 負(fù)載，然后通過流式細(xì)胞儀分析CD4+T 淋巴細(xì)

7、[Ca2+]I 熒光強(qiáng)度。2）分離純化的CD4+T 淋巴細(xì)胞懸液接種到96 孔培養(yǎng)板。細(xì)胞用20 μM BAPTA/AM 預(yù)處理1 h 后，在不同濃度的hsBAFF（0.5、2.5 μg/ml）
　　 與有或沒有anti-CD3（1 μg/ml）共刺激作用72 h，MTT 分析其增殖效應(yīng)，或用0.5 μM Tg和不同濃度的hsBAFF（0.5、2.5 μg/ml）與有或沒有anti-CD3 共刺激作用24、48h h，然后檢測(cè)細(xì)

8、胞活性。結(jié)果 hsBAFF 激活的CD4+T 淋巴細(xì)胞[Ca2+]I 熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組；BAPTA/AM 鰲合[Ca2+]I 干擾hsBAFF 對(duì)CD4+T 淋巴細(xì)胞增殖；Tg 明顯降低B 淋巴細(xì)胞存活率，然而，hsBAFF 明顯削弱或緩解Tg 導(dǎo)致的CD4+T 淋巴細(xì)胞[Ca2+]I 紊亂引發(fā)的細(xì)胞凋亡。提示：hsBAFF 通過上調(diào)[Ca2+]I 水平活化CD4+T 淋巴細(xì)胞，hsBAFF在增強(qiáng)CD4+T 淋巴細(xì)胞[Ca2+]I