經(jīng)皮穿刺CPC-FG-OM復(fù)合材料股骨頭填充聯(lián)合hBMSCs移植治療股骨頭壞死的初步研究.pdf

1、第一章自體血清培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的可行性評(píng)估
　　 目的:
　　 胎牛血清體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增加體內(nèi)移植的風(fēng)險(xiǎn)，限制其臨床應(yīng)用。本部分實(shí)驗(yàn)旨在探討自體血清體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的可行性。
　　 方法:
　　 全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離、純化人骨髓間充質(zhì)干原代細(xì)胞，取第三代細(xì)胞按加入培養(yǎng)血清的不同分為胎牛血清培養(yǎng)組和自體血清培養(yǎng)組。倒置相差顯微鏡觀察兩組培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況;使用MTT法測(cè)定兩組培

2、養(yǎng)傳代第3代細(xì)胞和第5代細(xì)胞的增殖情況，繪制細(xì)胞增殖曲線;取兩組培養(yǎng)傳代第3代細(xì)胞行成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并分別對(duì)成軟骨細(xì)胞行甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原染色;對(duì)成骨細(xì)胞行堿性磷酸酶(ALP)染色、VonKossa染色;對(duì)成脂肪細(xì)胞行油紅O染色，并計(jì)算兩組細(xì)胞誘導(dǎo)分化陽(yáng)性率;取自體血清培養(yǎng)組傳代第5代細(xì)胞行流式細(xì)胞儀測(cè)定鑒定細(xì)胞表面CD34、CD44、CD45、CD90抗原表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 倒

3、置相差顯微鏡下觀察全骨髓貼壁法分離純化的原代細(xì)胞形態(tài)均一，呈長(zhǎng)梭形，兩組培養(yǎng)細(xì)胞近融合狀態(tài)均呈漩渦樣同向生長(zhǎng)特征;MTT測(cè)定兩組培養(yǎng)第3代及第5代細(xì)胞均具備良好的生長(zhǎng)增殖潛能，第3-6d是增殖對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，兩組細(xì)胞增殖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;兩組培養(yǎng)第3代細(xì)胞均能在特定誘導(dǎo)環(huán)境下向成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及成脂肪細(xì)胞分化，成軟骨細(xì)胞經(jīng)甲苯胺藍(lán)染成藍(lán)紫色，Ⅱ型膠原染成黃色;成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色(ALP)陽(yáng)性，VonKossa鈣結(jié)節(jié)染成黑色;成脂肪細(xì)胞內(nèi)

4、經(jīng)油紅O染成紅色脂滴，兩組誘導(dǎo)分化細(xì)胞陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;自體血清培養(yǎng)組第5代細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面不表達(dá)CD34、CD45，而表達(dá)CD44、CD90。
　　 結(jié)論:
　　 全骨髓貼壁培養(yǎng)法操作簡(jiǎn)單，細(xì)胞純化率高;自體血清培養(yǎng)組細(xì)胞保持了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞典型的生長(zhǎng)特征、增殖以及誘導(dǎo)分化潛能;自體血清培養(yǎng)組細(xì)胞表面不表達(dá)造血干細(xì)胞表面抗原，而表達(dá)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特征。
　　 第二

5、章 CPC/FG/OM復(fù)合材料的研制及理學(xué)性質(zhì)測(cè)定
　　 目的:
　　 股骨頭壞死是臨床治療上頗為棘手的問題之一。有研究表明壞死股骨頭軟骨下骨板的支撐是治療股骨頭壞死的關(guān)鍵因素。磷酸鈣骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）材料是一種兼?zhèn)湫迯?fù)與成型的骨組織修復(fù)材料，具備自固化與骨傳導(dǎo)特性。但是由于材料本身的缺陷存在抗壓強(qiáng)度低，無(wú)骨誘導(dǎo)活性等缺點(diǎn)，限制了其在人體負(fù)重區(qū)域的臨床應(yīng)用。纖維蛋白膠（fi

6、brin glue，F(xiàn)G）是臨床上廣泛應(yīng)用的粘合劑，與CPC復(fù)合能夠利用其粘性增加CPC的抗壓強(qiáng)度。成骨誘導(dǎo)劑(osteogenesis medium，OM)已被證實(shí)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有著誘導(dǎo)成骨分化的作用。本部分實(shí)驗(yàn)旨在研制一種新型的適用于治療股骨頭壞死的填充材料—CPC/FG/OM復(fù)合材料，以期復(fù)合材料即能夠保留單純CPC材料自固化及優(yōu)良骨傳導(dǎo)性的優(yōu)點(diǎn)，又能夠通過加入FG增強(qiáng)材料的抗壓強(qiáng)度以滿足人體負(fù)重區(qū)域抗壓強(qiáng)度要求以及加入OM增

7、加材料的成骨誘導(dǎo)活性以改善壞死股骨頭內(nèi)的成骨內(nèi)環(huán)境。
　　 方法:
　　 將OM加入FG中制備FG/OM溶液，按照3∶1的粉末/液體比例配置CPC/FG/OM復(fù)合材料，按照相同的粉末/液體比值配置CPC/FG復(fù)合材料及CPC材料作為兩組對(duì)照組。對(duì)三組材料進(jìn)行掃描電鏡觀察材料表面結(jié)構(gòu);XRD晶體分析;凝固時(shí)間（吉爾摩針法）、抗壓強(qiáng)度、彈性模量（MTS S10力學(xué)性能實(shí)驗(yàn)機(jī)測(cè)試）以及孔隙率的測(cè)定（阿基米德法）。
　　

8、 結(jié)果:
　　 三組材料掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)單純CPC材料表面孔隙分布均勻，孔隙較小，而CPC/FG及CPC/FG/OM兩種復(fù)合材料表面孔隙分布不均勻，孔隙尺寸大;XRD分析顯示三種材料的XRD曲線與羥基磷灰石相似;CPC/FG及CPC/FG/OM兩種材料初凝時(shí)間[(6.8±0.5)min，(7.28±0.6)min]明顯長(zhǎng)于CPC材料[(3.38±0.4)min]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，三種材料終凝時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

9、(P＞0.05); CPC/FG及CPC/FG/OM兩種材料抗壓強(qiáng)度及彈性模量[(8.94±0.5)MPa，(9.1±0.4) MPa;(2.73±0.07)GPa，(2.846±0.1)GPa]明顯高于CPC材料組[(5.08±0.5)MPa，(1.064±0.14)GPa]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);CPC/FG及CPC/FG/OM兩種材料孔隙率[（38.64±1.5）％，（37.9±1.4）％]明顯低于CPC材料組[（48

10、.82±8.2）％]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 三種材料晶體相與羥基磷灰石一致，證實(shí)體內(nèi)降解產(chǎn)物與人體骨骼無(wú)機(jī)成分相同;CPC/FG/OM復(fù)合材料中OM的加入沒有影響其理學(xué)性質(zhì):凝固時(shí)間滿足臨床經(jīng)皮穿刺的可注射性要求;抗壓強(qiáng)度及彈性模量與CPC/FG復(fù)合材料相仿，明顯高于CPC材料，達(dá)到壞死股骨頭軟骨下骨板的填充材料抗壓強(qiáng)度要求;孔隙率與CPC/FG復(fù)合材料相仿，明顯低于CPC材料，但是由于