尿酸對(duì)血管內(nèi)皮功能影響的細(xì)胞模型建立和相關(guān)研究.pdf

1、隨著人民生活水平的提高,高尿酸血癥的患病率呈逐年上升趨勢(shì)。越來越多的流行病學(xué)研究提示,高尿酸血癥與心血管疾病的發(fā)生及預(yù)后有一定相關(guān)性,但人血清尿酸水平是否是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素尚不能定論。血管內(nèi)皮功能障礙是心血管疾病發(fā)生的基礎(chǔ),但由于體外建立內(nèi)皮細(xì)胞模型的方法不一,關(guān)于尿酸如何影響血管內(nèi)皮功能的基礎(chǔ)研究結(jié)果存在著很大的差異。
　　 目的：探索建立類似生理狀態(tài)的內(nèi)皮細(xì)胞體外研究模型:并在此基礎(chǔ)上研究尿酸獨(dú)立和/或ox-LDL體

2、外對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響,為合理治療高尿酸血癥提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 內(nèi)容及方法：本研究分為2個(gè)部分,第1部分是體外血管內(nèi)皮細(xì)胞模型的建立:將HUVEC體外培養(yǎng)于不同培養(yǎng)基條件下,觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變,并于不同增殖點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)來分析細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；最后通過給予不同濃度ox-LDL刺激HUVEC24h后,觀察各培養(yǎng)基條件下HUVEC eNOS的表達(dá)情況,從而確定適宜的體外內(nèi)皮細(xì)胞模型。第2部分是應(yīng)用第1部分建立的體外細(xì)胞模型,研

3、究尿酸對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響:1)不同濃度的尿酸(5、10、15及20 mg/d1)單獨(dú)作用于HUVEC24h、48h及72h后,通過Real-time PCR、Western blotting方法觀察HUVEC eNOS及ICAM-1的表達(dá),并應(yīng)用硝酸還原酶法及ELISA法分別測(cè)定上清中NO及s-ICAM的水平,綜合分析尿酸單獨(dú)作用下對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響；2)在50μg/ml ox-LDL存在時(shí),不同濃度的尿酸(5 mg/dl及20 m

4、g/dl)分別作用HUVEC24h、48h及72h后,應(yīng)用Real-time PCR法觀察HUVEC eNOS及ICAM-1的變化,進(jìn)而評(píng)價(jià)尿酸聯(lián)合ox-LDL共同作用下血管內(nèi)皮功能的情況。
　　 結(jié)果：第1部分:HUVEC培養(yǎng)于完全ECM或2:1ECM/DMEM培養(yǎng)基下,細(xì)胞指數(shù)增長(zhǎng)高峰出現(xiàn)于24h之內(nèi)并持續(xù)至72h；HUVEC培養(yǎng)于1:1ECM/DMEM培養(yǎng)基中細(xì)胞指數(shù)增長(zhǎng)高峰出現(xiàn)于24h左右,生長(zhǎng)情況最符合體外細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)律

5、；HUVEC培養(yǎng)于1:2ECM/DMEM培養(yǎng)基中,顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞性狀不能保持,且生長(zhǎng)曲線沒有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期。50μg/ml ox-LDL在3種培養(yǎng)基條件下都能明顯下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá),20μg/ml ox-LDL可以使培養(yǎng)于1:1或2:1ECM/DMEM培養(yǎng)基中的HUVEC表達(dá)eNOS減少,而在1:1ECM/DMEM培養(yǎng)基條件下,10μg/mlox-LDL即可導(dǎo)致HUVEC表達(dá)eNOS降低(P<0.05),表明這個(gè)培養(yǎng)條件可以

6、敏感反映低濃度的ox-LDL對(duì)血管內(nèi)皮的損傷。
　　 第2部分:1)高濃度尿酸(10、15及20 mg/dl)單獨(dú)作用HUVEC24h、48h及72h時(shí),可以使eNOS mRNA及蛋白表達(dá)降低,上清中NO產(chǎn)生減少(P<0.05)；同時(shí),明顯上調(diào)HUVEC ICAM—1 mRNA的表達(dá)(P<0.05),但僅24h時(shí)出現(xiàn)ICAM-1蛋白表達(dá)的下降以及上清s-ICAM的升高(P<0.05),且二者的變化趨勢(shì)正好相反,提示s-ICAM可

7、能是由細(xì)胞表面ICAM-1蛋白斷裂脫落而來,綜合分析ICAM-1的表達(dá)在尿酸刺激后上調(diào)。因此,高濃度尿酸可以損傷內(nèi)皮功能,并呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性。5 mg/dl的尿酸在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)eNOS的表達(dá)、NO的產(chǎn)生以及ICAM-1 mRNA及蛋白的表達(dá)都沒有影響(P>0.05),但在48h及72h時(shí)顯著降低上清s-ICAM的水平,提示正常生理水平的尿酸存在不僅不會(huì)損傷內(nèi)皮,還可能參與內(nèi)皮的保護(hù)機(jī)制。2)當(dāng)50μg/ml ox-LDL存在時(shí),尿酸5

8、及20 mg/dl都會(huì)顯著下調(diào)HUVEC eNOS的表達(dá),且下調(diào)程度要重于正常條件下尿酸的下調(diào)力度(P<0.05),說明尿酸與ox-LDL對(duì)內(nèi)皮的損傷有明顯的協(xié)同作用,當(dāng)ox-LDL存在時(shí),任何水平的尿酸都有可能進(jìn)一步加重內(nèi)皮受損程度。但當(dāng)二者共同刺激HUVEC24及48h時(shí),會(huì)下調(diào)ICAM-1的mRNA的表達(dá)(P<0.05),考慮可能是短期內(nèi)內(nèi)皮功能代償保護(hù)的結(jié)果。
　　 結(jié)論：第1部分:1:1ECM/DMEM體外培養(yǎng)的HUV