采用RNA干擾技術抑制非小細胞肺癌表皮生長因子受體表達的實驗研究.pdf

1、復旦大學博士學位論文采用RNA干擾技術抑制非小細胞肺癌表皮生長因子受體表達的實驗研究姓名：張敏申請學位級別：博士專業(yè)：內(nèi)科學指導教師：白春學20040330期為腫瘤治療提供新的思路和實驗依據(jù)。方法：(1)建立檢測EGFR數(shù)量的方法，測定A549、SPC—A1細胞株EGFR的表達。(2)體外化學合成EGFR序列特異性雙鏈RNA(dsRNA—EGFR)，與Lipofectamine2000結合后轉(zhuǎn)染細胞，采用熒光顯微鏡、Westernblo

2、t技術和流式細胞儀檢測EGFR表達，采用Real—timePCR檢測EGFR基因水平，觀察dsRNA—EGFR／LipofectamJne2000對EGFR表達的抑制作用。(3)采用流式細胞儀測定細胞周期，采用ELISA法測定配體EGF含量，結合細胞計數(shù)、集落形成、刮痕實驗、化療敏感l(wèi)i3)“析觀察抑制EGFR表達后，A549、SPCA1細胞生物學特性的改變。結果：A549、SPC—A1細胞株存在EGFR高表達。dsRNA—EGFR／L

3、ipofectamine2000復合物轉(zhuǎn)染細胞可引發(fā)EGFR序列特異性基因沉默效應，熒光顯微鏡下觀察、流式細胞儀檢測、WesternBlot分析得到了一致的結果。對于A549細胞，與對照組比較，dsRNAEGFR組EGFR基因及蛋白水平分別下調(diào)了3704％、7131％，細胞生【丈抑制了85，O％，集落形成抑制了633％，細胞遷移能力明顯降低。細胞周期分析結果表明dsRNAEGFR組G。一G期細胞百分數(shù)較對照組增加了1267％，進入s期的

4、細胞百分數(shù)較對照組減少了656％。轉(zhuǎn)染dsRNA—EGFR后可將A549細胞對順鉑的敏感性提高約4倍。ELISA結果表明dsRNk—EGFR組培養(yǎng)液及細胞抽提蛋白Ifl的1i5F分別降低了2774％、1107％；對于SPC—A1細胞，與對照組比較，dsRNAEGFR組EGFR基因及蛋白水平分別下調(diào)了5000％、7178％，細胞生長抑制了783％，集落形成抑制了668％，細胞遷移能力明顯降低。細胞周期分析結果表明dsRNA—EGFR組Go

5、G，期細胞百分數(shù)較對照組增加了1748％，進入s期的細胞百分數(shù)較對照組減少了1920％。轉(zhuǎn)染dsRNA—EGFR后可將SPC—A1細胞對順鉑的敏感性提高約7倍。ELISA結果表明dsRNA—EGFR組培養(yǎng)液及細胞抽提蛋白中的EGF分別降低了4565％、2245％。結論：(1)NSCLC細胞株存在EGFR高表達。(2)dsRNA—EGFR可序列特異性下調(diào)NSCLC細胞EGFR基因水平，顯著降低EGFR蛋白表達。(3)dsRNA—EGFR通

6、過抑制EGFR表達可濕轉(zhuǎn)抑制細胞增生和細胞遷移，降低配體EGF的含量，將更多的細胞m滯任GG期，增加細胞對順鉑的敏感性，有效逆轉(zhuǎn)NSCLC細胞的惡性表型，從而為NSCLC基因治療提供了新策略。關鍵詞：表皮生睦因子受體；RNA干擾：小干擾RNA；雙鏈RNA；非小細胞肺癌第三部分RNA干擾技術抑制NSCLC細胞EGFR表達的在體實驗研究目的：探討采用體外化學合成的小干擾RNA(siRNA)結合陽離子脂質(zhì)體是否能有效在體轉(zhuǎn)染NSCLC細胞，以