宮頸癌蛋白質(zhì)質(zhì)譜變化研究.pdf

1、1 目的 為了能夠建立用于宮頸癌和癌前病變的診斷與宮頸癌篩查的血清蛋白質(zhì)組合，進一步了解宮頸癌的發(fā)生機制，本研究采用SELDI-TOF-MS技術對宮頸癌與健康女性的血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜變化進行研究，進行差異表達的蛋白質(zhì)篩選，然后在宮頸癌前病變患者、宮頸癌行廣泛子宮切除加盆腔淋巴結(jié)清掃術后以及其后進行隨訪的患者血清中，進行同組蛋白質(zhì)含量的凇驗，以了解它們在無瘤-有瘤一無瘤生存模式全過程中的變化，以期篩選出能夠監(jiān)測宮頸癌全過程的蛋白質(zhì)組合

2、，如宮頸癌的早期診斷、治療效果的評價以及預后的評估。 2 材料與方法 2.1研究對象 樣本來自鄭州大學第一附屬醫(yī)院，入選要求：病理資料完整，無放療或化療等針對宮頸癌的治療。 2.1.1血清標本①宮頸癌49例，其中鱗癌45例(91.84％)，腺癌4例(8.16％)；FIGO分期Ⅰ b-Ⅱ a期39例(79.59％)，Ⅱ a期以上lO例(20.41％)。中位年齡47歲(25歲-75歲)。以及年齡相配的健康女性

3、71例。②宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intra-epithelial neoplasia，CIN)67例，其中CIN Ⅰ-Ⅱ級35例， CIN Ⅲ級32例。③宮頸癌Ⅰ b-Ⅱa期行廣泛子宮切除和盆腔淋巴結(jié)清掃手術后10天者24例，術后3月復診者22例，術后1年隨訪者18例。 2.1.2組織標本宮頸癌組織33例，正常宮頸上皮組織29例。 2.2標本收集 2.2.1血清標本清晨空腹靜脈血3ml，靜置30min

4、，2000rpm，離心20min，每管100μl分裝，-80℃冰箱保存。 2.2.2組織標本宮頸癌行廣泛子宮全切加盆腔淋巴結(jié)清掃手術，標本離體后立即剖開宮頸，清理宮頸黏液，靠近癌組織基底部取材，同時在距癌組織邊緣≥1cm處選取正常宮頸上皮，初步切碎后用0.25％胰蛋白酶消化30分鐘，Hank's液沖洗，900rpm離心10min，去除上清夜，重復沖洗離心共3次，行細胞涂片常規(guī)病理檢查，同時行細胞記數(shù)，要求目標細胞(正常宮頸上皮細

5、胞或?qū)m頸癌細胞)≥85％，細胞計數(shù)1×10<'7>/ml，做好標記，置于-80℃保存。 2.3研究方法 2.3.1芯片準備將IMAC-Cu芯片(immobilized metal affinity capture arrays-Cu，IMAC-Cu)置于操作平臺，每孔加50 μl 100mmol/L硫酸銅，振蕩5min，倒除硫酸銅，去離子水沖洗5次，甩干；每孔中加入50 μl的100mmol/L醋酸鈉(PH4.0)使之中

6、和，振蕩5min，去離子水沖洗5次，甩干；每孔加入結(jié)合緩沖液150μl(pH7.0)使之平衡，振蕩器震蕩5min后除去緩沖液，重復一次。 2.3.2血清樣本的處理樣本冰盒上融化，以10μl血清加20μl(1：2)的比例加入U9緩沖液混勻，4℃震蕩30min，使蛋白質(zhì)變性，取10μl變性后的樣品加120μl的結(jié)合緩沖液，4℃震蕩30min備用。 2.3.3組織樣本處理樣本冰盒上融化，加入50μl細胞裂解液，4℃震蕩30mi

7、n，15 000rpm，4℃離心10min，取上清夜20μl，以1：2的比例加入U9緩沖液，4℃震蕩30min，使蛋白質(zhì)變性，取10μl變性后的樣品加120μl的結(jié)合緩沖液，4℃震蕩30min備用。 2.3.4蛋白質(zhì)結(jié)合反應在處理好的芯片中每孔加入50μl處理好的樣品(血清/組織)，4℃震蕩60min；每孔加入150μl結(jié)合緩沖液，振蕩5min，棄去緩沖液，重復操作一次；每孔分兩次加入能量吸收分子飽和溶液，每次0.5μl，兩次之

8、間允許各孔風干。 2.3.5數(shù)據(jù)收集和生物信息學處理將芯片放入質(zhì)譜閱讀儀檢測，在ProteinChip software(Ciphergen，Inc)支持下，設定讀片程序。在樣本芯片閱讀檢測前，用加有All-in-one標準蛋白質(zhì)的NP20芯片校正質(zhì)譜儀，使分子量檢測誤差<0.1％，再以質(zhì)控蛋白芯片做重復性檢測，質(zhì)譜峰值強度(高度)的變異系數(shù)控制在15％以下。設定SELDI-TOF-MS激光強度為170，診斷率為6，優(yōu)化分子量范

9、圍為2 000-20 000Da，最高分子量為50，000Da，行低、高能量兩次檢測，平均收取90個激光點。利用Biomarkerr Wizard Software(類似統(tǒng)計學軟件)進行噪音過濾以及統(tǒng)計學分析，組間相同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)峰平均強度值做組間t檢驗，得出該蛋白質(zhì)在兩樣本之間表達的差異。采用Biomarker Patterns Software(數(shù)據(jù)挖掘軟件)建立決策樹分類模型，即：將初步篩選出的蛋白質(zhì)質(zhì)譜信息資料輸入這個軟件系統(tǒng)

10、，軟件讀取，建立最大決策樹分類模型及源于該模型的較小決策樹，決策樹會依據(jù)質(zhì)譜峰強度的不同將樣本分到不同的兩個節(jié)點內(nèi)，而后每一個節(jié)點內(nèi)的樣本又會根據(jù)一個新的質(zhì)譜峰的強度值再分類，當一個樣本中的質(zhì)譜峰強度小于或等于這個選定的閾值時，就被分到左邊的節(jié)點內(nèi)，否則分到右側(cè)，直到所有輸入的樣本都被分到終節(jié)點為止，進入模型分類時錯誤率最低的質(zhì)譜峰被選為分類變量。用10倍交叉驗證(10-fold cross validation)方法對決策樹進行驗證，

11、找出錯誤率最低的決策樹分類模型，同時得到該分類模型對樣本的診斷率(敏感度)和排除率(特異度)。 2.3.6差異表達蛋白質(zhì)的t檢驗將從宮頸癌患者與健康女性血清中篩選出的具有分類意義的差異表達蛋白質(zhì)作為一組，同其從CIN Ⅰ-Ⅱ級、CIN Ⅲ級、宮頸癌手術治療后以及其后隨訪各組的SELDI-TOF-MS檢測中得到的原始數(shù)據(jù)進行t檢驗(SPSS 11.0) 結(jié)論 4.1 宮頸癌和健康對照組血清蛋白質(zhì)資料分析 質(zhì)

12、荷比為M8929.31，M7930.52，M9127.31，M8141.01，M7963.06，M9280.63的一組蛋白質(zhì)與宮頸癌的發(fā)生密切相關，在宮頸癌患者血清中低表達，推測它們可能是正常宮頸上皮的具有生理功效的一組蛋白質(zhì)或多肽，也可能是一組重要的保護因素或抑癌因子。這組蛋白質(zhì)的表達變化，反映了宮頸癌的重要特征性分子學改變，有可能成為與宮頸癌相關的重要生物學標記物。 4.2 宮頸癌前病變組血清蛋白質(zhì)資料分析 質(zhì)荷比為

13、M8929.31，M7930.52，M9127.31，M8141.01，M7963.06，M9280.63的一組蛋白質(zhì)含量,由正常對照、CIN Ⅰ-Ⅱ級、CIN Ⅲ級到宮頸癌，依次依P<0.01水平降低，推測它們與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，驗證了它們可能是正常宮頸上皮的具有生理功效的一組蛋白質(zhì)或多肽，也可能是一組重要的保護因素，或抑癌因子。提示：經(jīng)過更多的資料補充和研究后可成為用于宮頸癌前病變的篩選以及宮頸癌早期診斷的一組生物學指標。

14、 4.3 宮頸癌術后及隨訪組血清蛋白質(zhì)資料分析 質(zhì)荷比為M8929.31，M7930.52，M9127.31，M8141.01，M7963.06和9280.63的一組蛋白質(zhì)，其含量在宮頸癌手術治療后逐漸回升，在手術后1年內(nèi)的時間里基本恢復至正常水平，提示：經(jīng)過大樣本隨訪資料補充和宮頸癌治療后復發(fā)及轉(zhuǎn)移患者此組血清蛋白質(zhì)含量的比較研究，有可能成為制定宮頸癌治療方案的依據(jù)、評價宮頸癌治療效果以及判斷預后使用的一組生物學指標。

15、 4.4宮頸癌組織與正常宮頸上皮組織資料分析 利用SELDI-TOF-MS技術從宮頸癌組織和正常宮頸上皮組織中篩選出的具有分類意義的8種蛋白質(zhì)，經(jīng)過進一步研究以及與宮頸癌血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術共同應用，有可能篩選出更為簡單實用能夠應用于臨床的免疫組化指標。 4.5本研究資料的綜合分析 質(zhì)荷比為M8929.31，M7930.52，M9127.31，M8141.01，M7963.06和9280.63的一組蛋白質(zhì)，其

16、血清含量由健康女性、CIN Ⅰ-Ⅱ級、CIN Ⅲ級到宮頸癌，依次依P<0.01水平降低，至宮頸癌時降低到最低水平，在宮頸癌手術治療后逐漸回升，在手術后的1年時間里基本恢復至正常水平。撇開它們在宮頸癌分子水平研究中的作用與地位，如果經(jīng)濟允許，可將它們從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中查出對應的蛋白質(zhì)，然后進行進一步的蛋白質(zhì)檢測與鑒定，同時進行大樣本的測試，并增加宮頸癌治療后的復發(fā)和轉(zhuǎn)移患者此組血清蛋白質(zhì)的監(jiān)測，以及進行生存資料的完善與補充，相信能夠?qū)⒈狙芯?/p>