sPLA2-ⅡA對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞MCP-1表達(dá)的影響及其機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　 動(dòng)脈粥樣硬化是一種動(dòng)脈壁慢性炎癥性疾病,其中含有apo-B脂蛋白顆粒在動(dòng)脈壁的潴留和修飾是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制特征之一,而分泌型磷脂酶A2-ⅡA(secretory phospholipase A2 of groupⅡA,sPLA2-ⅡA)可水解磷酸卵磷脂的2位酯鍵,sPLA2-ⅡA修飾的LDL與蛋白聚糖的親和力增加,促進(jìn)脂蛋白潴留,其水解后生成的游離脂肪酸和溶血磷脂,可產(chǎn)生重要的信號(hào)分子或進(jìn)一步成為炎性介質(zhì),

2、從而改變內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的功能和特性,促動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。目前研究已表明血清升高的sPLA2-ⅡA是造成AS的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素,但是其致動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制不十分明確。
　　 目的：
　　 利用基因體外合成技術(shù),全基因合成人分泌型磷脂酶sPLA2-ⅡA基因片段,構(gòu)建含人sPLA2-ⅡA基因的慢病毒載體,感染人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,并研究其在人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)及致動(dòng)脈粥樣硬化炎癥作用。
　　

3、 方法：
　　 根據(jù)Gene Bank中sPLA2-ⅡA的基因序列,全基因合成人sPLA2-ⅡA基因片段,構(gòu)建含sPLA2-ⅡA基因的慢病毒載體。體外培養(yǎng)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC),將慢病毒載體感染人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá),感染后72h加入OXLDL以及LY294002干預(yù),收集人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,提取mRNA,逆轉(zhuǎn)錄為eDNA,Real-time PCR方法檢測(cè)sPLA2-ⅡA mRNA

4、表達(dá)水平與炎癥因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的mRNA表達(dá)水平,ELISA法檢測(cè)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的蛋白表達(dá)水平。所有數(shù)據(jù)資料用Graphpadprism5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.擴(kuò)增出人sPLA2-ⅡA基因片段,構(gòu)建含人sPLA2-ⅡA基因的慢病毒載體。測(cè)序表明構(gòu)建的sPlA2-Ⅱ A慢病毒準(zhǔn)確

5、;
　　 2.體外培養(yǎng)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,慢病毒感染入主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá),表明慢病毒感染真核細(xì)胞成功;
　　 3.感染sPLA2-ⅡA慢病毒的HASMC與ox-LDL共培養(yǎng),以及與ox-LDL+PI3K抑制劑LY294002共培養(yǎng),其中sPLA2-ⅡA慢病毒HASMC+OXLL組MCP一在1的mRNA及蛋白表達(dá)升高(P＜0.05),而含LY294002組MCP-1的