AOPP對(duì)血管平滑肌細(xì)胞MCP-1表達(dá)及其信號(hào)通路的研究.pdf

1、研究背景 心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)是慢性腎功能衰竭(Chronic renalfailure，CRF)病人，尤其是終末期腎病病人(End-stage renal disease，ESRD)最常見的并發(fā)癥和最主要的死亡原因。透析治療技術(shù)的長(zhǎng)足進(jìn)步雖然顯著地減少了威脅終末期腎病患者急性事件的發(fā)生，但CRF病人并發(fā)心血管疾病而導(dǎo)致的死亡仍居高不下。長(zhǎng)期透析病人死亡原因中，有50％系心血管事件所

2、引起，是普通人群CVD導(dǎo)致死亡的10～20倍，說明CVD是威脅依賴性透析病人長(zhǎng)期生存的主要因素。雖然血脂和血糖代謝紊亂、高血壓等CVD危險(xiǎn)因素在透析病人的發(fā)生率明顯高于普通人群，但仍然不能滿意解釋CRF病人CVD如此高的發(fā)病率和死亡率，提示尿毒癥毒素可能是其促發(fā)因素之一。研究表明，已有多種尿毒癥毒素與CVD有關(guān)，特別是新發(fā)現(xiàn)的尿毒癥毒素AOPP已證明與動(dòng)脈粥樣硬化有明確關(guān)系，但其機(jī)制尚在研究中。進(jìn)一步明確其機(jī)制，對(duì)防治這一常見并發(fā)癥具有

3、極大的臨床意義。 晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advanced oxidation protein products，AOPP)是Witko-Sarsat等于1996年首先報(bào)道的由尿毒癥血液透析患者血漿中分離出的含有雙酪氨酸的蛋白交聯(lián)產(chǎn)物，系因患者體內(nèi)過高的氧化應(yīng)激水平導(dǎo)致各種蛋白質(zhì)氧化損傷所形成的終末產(chǎn)物的總稱。AOPP隨著慢性腎功能衰竭及氧化應(yīng)激的進(jìn)展，在患者的循環(huán)和組織中潴留，是一類新的尿毒癥毒素。AS患者血漿AOPP水平明顯高于正

4、常人。血液透析的CRF病人頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度與血漿AOPP水平呈正相關(guān)。靜脈反復(fù)注射AOPP可加速飼喂高膽固醇飼料兔AS斑塊的形成。上述研究提示，AOPP可能參與了AS的形成，但其機(jī)制目前還不清楚。單核細(xì)胞黏附于血管壁并穿入內(nèi)皮下形成泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化的早期病變，而平滑肌細(xì)胞增生、遷移形成平滑肌肌源性泡沫細(xì)胞是該病較晚期病變。大量研究表明單核細(xì)胞的趨化主要由單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocytechemoattractant prote

5、in-1，MCP-1)MCP-1來實(shí)現(xiàn)，多種物質(zhì)及細(xì)胞因子都可以誘導(dǎo)MCP-1的表達(dá)，而MCP-1也可在多種細(xì)胞尤其是構(gòu)成動(dòng)脈粥樣硬化病變的三種主要細(xì)胞一單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中表達(dá)。有報(bào)道，AOPP通過氧化應(yīng)激引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能是其參與AS發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制之一。然而，AOPP對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的影響尚無報(bào)道。本研究采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)探討AOPP是否通過對(duì)血

6、管平滑肌細(xì)胞單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)的影響而參與了動(dòng)脈粥樣硬化的晚期病變的可能機(jī)制。細(xì)胞外信號(hào)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)導(dǎo)信息時(shí)，需要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的參與。絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，細(xì)胞運(yùn)用這一系統(tǒng)將細(xì)胞外刺激信號(hào)傳遞到細(xì)胞核，介導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞MAPK通路主要有：ERK，JNK/SAPK，p38三條途徑及目前所知相對(duì)較少的ERK5等通路。有研究提示，p38信號(hào)通路很可能是各種致AS病變因素的共同通路

7、。本研究也對(duì)p38-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路在AOPP誘導(dǎo)MCP-1表達(dá)過程中的地位和作用了進(jìn)行研究，為阻斷這一途徑尋找理論依據(jù)。并在臨床觀察不同透析模式對(duì)清除AOPP的影響及大劑量維生素C預(yù)沖透析器對(duì)尿毒癥患者AOPP的影響，為探索臨床防治CRF并發(fā)癥尋找新方法。 結(jié)果 1、AOPP以時(shí)間和劑量依賴的方式刺激血管平滑肌細(xì)胞合成分泌MCP-1增多。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，AOPP刺激的鼠血管平滑肌細(xì)胞M

8、CP-1的表達(dá)呈濃度依賴性；400μmol/L AOPP刺激的MCP-1與陽性對(duì)照者的MCP-1在相同時(shí)間表達(dá)水平一致。AOPP-HSA 400μmol/L不能使VSMCs3對(duì)MCP-1的表達(dá)進(jìn)一步升高。MCP-1蛋白質(zhì)濃度從干預(yù)后一直呈升高趨勢(shì)，24h仍維持較高水平，與12h組相比，差異無顯著性意義(說明12小時(shí)已經(jīng)達(dá)高峰)。 2、AOPP以時(shí)間和劑量依賴的方式刺激血管平滑肌細(xì)胞高表達(dá)MCP-1 mRNA。MCP-1mRNA在

9、未被干預(yù)的VSMCs中有表達(dá)，隨AOPP-HSA濃度逐步升高．MCP-1的表達(dá)水平也逐步升高，mRNA表達(dá)高峰在200μmol/L。干預(yù)1h時(shí)，MCP-1mRNA的表達(dá)較基礎(chǔ)狀態(tài)明顯上升，4h達(dá)高峰，在24h時(shí)完全停止。 3、為了證明A()PP作用的特異性，我們?cè)赪estern blot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)中觀察了兩種不同的AOPP(AOPP-HSA，AOPP-BSA)和兩種非AOPP修飾的蛋白質(zhì)(HSA，BSA)對(duì)MCP-1合成

10、的影響，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)AOPP修飾的HSA或BSA對(duì)平滑肌細(xì)胞合成MCP-1無刺激作用，且AOPP-HSA和AOPP-BSA作用之間無明顯差異，說明AOPP特異刺激平滑肌細(xì)胞合成釋放MCP-1，而不是蛋白質(zhì)本身的作用；為了排除可能存在的內(nèi)毒素對(duì)試驗(yàn)的影響，我們觀察了內(nèi)毒素鰲合劑多粘菌素B(PMX-B)對(duì)AOPP刺激平滑肌細(xì)胞合成MCP-1作用的影響。結(jié)果顯示，加入PMXB后，AOPP3對(duì)MCP-1合成的刺激作用沒有消失或減弱，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有

11、受到內(nèi)毒素的干擾。 4、在刺激平滑肌細(xì)胞生成MCP-1的同時(shí)，AOPP以時(shí)間和劑量依賴的方式活化p38-MAPK信號(hào)途徑。p38通路的特異阻斷劑SB203580能夠阻斷AOPP對(duì)平滑肌細(xì)胞合成釋放MCP-1的促進(jìn)作用，說明AOPP對(duì)平滑肌細(xì)胞合成MCP-1的刺激作用是經(jīng)由1938-MAPK途徑介導(dǎo)的。 5、尿毒癥病人(未行血液透析)的AOPP較正常對(duì)照組顯著升高，而經(jīng)過半年血液透析的病人其AOPP較未透析病人又明顯升高，

12、但透析前經(jīng)過大劑量維生素C預(yù)處理透析器后其AOPP明顯下降。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單次HD治療，其AOPP略有下降，半年后，AOPP水平明顯升高，HDF治療組則明顯下降；單次HP治療后，AOPP水平明顯下降，但半年后差異無顯著性意義。 結(jié)論 1、AOPP通過促進(jìn)鼠平滑肌細(xì)胞MCP-1mRNA和蛋白表達(dá)參與了尿毒癥患者加速性動(dòng)脈粥樣硬化的病變過程。 2、由于AOPP誘導(dǎo)的鼠血管平滑肌細(xì)胞MCP-1的表達(dá)經(jīng)P38MAPK