羅格列酮對(duì)高糖孵育下大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分泌MCP-1的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：大血管病變是2型糖尿病致死致殘的主要原因，而動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病大血管病變的主要病理改變，其發(fā)生發(fā)展到轉(zhuǎn)歸的過程是一個(gè)慢性炎癥過程。在炎癥過程中，血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)參與了血管新生內(nèi)皮和動(dòng)脈粥樣斑塊的形成與發(fā)展。動(dòng)脈粥樣硬化(AS)形成的中期，VSMC從一個(gè)有收縮功能的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成具有增殖和分泌功能的細(xì)胞，并可以分泌許多細(xì)胞因子。其中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)是一種重要的炎癥趨化刺激因子，大量實(shí)驗(yàn)研究提示它是胰島素抵抗

2、、2 型糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的危險(xiǎn)因子。文獻(xiàn)報(bào)道，糖尿病患者血清MCP-1水平與大血管病變密切相關(guān)。 羅格列酮屬于噻唑烷二酮類(TZDs)藥物，是人工合成的過氧化體增殖物激活型受體-γ(PPAR-γ)的高親和性配體。近來研究表明，羅格列酮除可降糖外，還具有大血管的保護(hù)作用。它具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的生理活性以及血管壁對(duì)炎癥刺激的反應(yīng)，阻止炎癥前因子生成；下調(diào)其它轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB信息轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，阻止AS斑塊的崩解和血栓形成，減輕

3、炎癥反應(yīng)；抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，減輕氧化應(yīng)激，抑制體外VSMC增生、遷移以及血管再狹窄，而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同葡萄糖濃度培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞其分泌MCP-1的變化的觀察，以及應(yīng)用PPAR-γ的激動(dòng)劑羅格列酮及其抑制劑GW-9662后對(duì)于MCP-1分泌水平的影響，來闡明不同血糖情況下平滑肌細(xì)胞MCP-1分泌水平的變化，以及羅格列酮的抗AS作用，并進(jìn)一步探討其發(fā)生作用的可能機(jī)制。 方法：正常健康清潔級(jí)5周

4、齡雄性Wister大鼠，重量在175±25g。按照貼塊法原代培養(yǎng)胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，經(jīng)鑒定為平滑肌細(xì)胞后，用酶消化法傳代，選取5～8代的平滑肌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，按如下分組隨機(jī)分為8組：(1)正常組A1組：5.6mmol/L葡萄糖組；(2)高糖B1組：11.2mmol/L葡萄糖組；(3)高糖C1組：22.4mmol/L葡萄糖組；(4)藥物干預(yù)組C2組：22.4mmol/L葡萄糖+10μmol/L羅格列酮組；(5)藥物干預(yù)C3組：22.4mmo

5、l/L葡萄糖+30 μmo兒羅格列酮；(6)藥物干預(yù)C4組：22.4mmol/L葡萄糖+100μmol/L羅格列酮組；(7)C5組：22.4mmol/L葡萄糖+100μmol/L羅格列酮+10μmol/L GW9662組：預(yù)先應(yīng)用GW9662孵育細(xì)胞30min后加入羅格列酮；(8)對(duì)照組D1組：5.6mmol/l葡萄糖+16.8mmol/l甘露醇。各組細(xì)胞孵育24小時(shí)后，取上清留存于-70℃，用ELISA法檢測(cè)各組MCP-1水平。Wes

6、tern Blot方法檢測(cè)各組所收集細(xì)胞胞漿中NF-kBp65和IkBα的表達(dá)。 結(jié)果： 1.高糖及羅格列酮對(duì)孵育的平滑肌細(xì)胞所分泌的MCP-1的影響：細(xì)胞上清液中B1組、C1組濃度分別為340.87±43.92pg/ml、664.87±23.07pg/ml，分別比A1組(132.20±5.81pg/ml)有顯著增加(P＜0.01)。而D1組(134.07±8.50pg/ml)與A1組差別不大(P＞0.05)℃2、C3、

7、C4組MCP-1濃度分別為581.30±19.42pg/ml、343.20±56.77pg/ml、236.27±16.85pg/ml，分別比C1組(即葡萄糖濃度為22.4mmol/L組664.87±23.07pg/ml)降低12.57％、48.38％、64.46％，P＜0.01。應(yīng)用GW9662預(yù)先處理后C5組細(xì)胞上清中濃度為401.67±34.66pg/ml，比C4組明顯增加，P＜0.01。 2.高糖及羅格列酮對(duì)各組所孵育的平

8、滑肌細(xì)胞中NF-kBp65和IkBa的表達(dá)的影響：NF-kBp65和IkBα在A1組的表達(dá)分別為0.18±0.02和0.60±0.09，與D1組的0.19±0.03和0.58±0.08無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；高糖孵育的B1、C1組NF-kBp65表達(dá)分別為0.27±0.03、0.34±0.04比A1組增加了47.9％和88.9％(P＜0.01)，且B1、C1兩組間也有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。IkBα的表達(dá)在B1、C1

9、組較A1組有顯著降低，(0.46±0.07 vs 0.60±0.09，0.34±0.03 vs 0.60±0.09，P＜0.01)，其中C1組相對(duì)B1組亦有明顯降低(P＜0.05)。 應(yīng)用羅格列酮干預(yù)后，隨著羅格列酮濃度的增加NF-kBp65水平呈漸降趨勢(shì)，其中在C3組(0.53±0.03)比C2組(0.66±0.05)減少了19.7％(P＜0.01)；C4組(0.45±0.06)比C3組又明顯減少了15.1％，相對(duì)C2組則減少

10、了31.8％(P＜0.01)，C5組NF-kBp65的蛋白表達(dá)為0.54±0.03比C4組有顯著增加(P＜0.01)。所培養(yǎng)C2、C3、C4組平滑肌細(xì)胞胞漿中IkBa蛋白表達(dá)依次明顯增加，分別為0.37±0.02，0.51±0.03和0.62±0.04(P＜0.01)，C5組相對(duì)C4組有明顯減低，為0.51±0.05(P＜0.01)。 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高糖能夠誘導(dǎo)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分泌的MCP-1增加，并在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依