人轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠整合位點研究.pdf

1、上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文1引言轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferring，TF）主要負(fù)責(zé)運(yùn)載由消化管吸收的鐵和由紅細(xì)胞降解釋放的鐵，并以TFFe3的復(fù)合物形式進(jìn)入骨髓中，供成熟紅細(xì)胞的生成。研究表明，轉(zhuǎn)鐵蛋白還具有抗菌活性，生長因子，清除有害的游離鐵，免疫調(diào)節(jié)活性[13]等功能。由于轉(zhuǎn)鐵蛋白具有多種生物學(xué)功能，在一些臨床疾病如：無轉(zhuǎn)鐵蛋白貧血癥[4]、缺血再灌注損傷[5]、骨髓移植[6]的治療中應(yīng)用很廣。自1982年世界上首次通過轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)

2、獲得“巨鼠”[7]以來，轉(zhuǎn)基因動物的研究發(fā)展迅速。隨著轉(zhuǎn)基因動物的出現(xiàn)，研究者設(shè)想利用動物表達(dá)外源基因，以動物個體作為一個反應(yīng)器來生產(chǎn)有價值的蛋白質(zhì)。由于動物乳腺作為外分泌器官，乳汁不進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)，不影響轉(zhuǎn)基因動物本身生理代謝反應(yīng)；并且外源蛋白產(chǎn)量高，易提純，經(jīng)充分修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性，因此乳腺生物反應(yīng)器顯示了很好的應(yīng)用前景。目前，百余種多肽類藥物、疫苗、抗體、酶制劑等已在不同種動物乳腺生物反應(yīng)器中表達(dá)，其中近30種重組蛋白產(chǎn)品

3、藥物已進(jìn)入臨床試驗不同階段，如用于治療抗凝血酶缺乏癥的抗凝血酶Ⅲ上市[8]。重組轉(zhuǎn)鐵蛋白的研究進(jìn)展如下表1所示：表1rhTF在不同表達(dá)系統(tǒng)中的比較[9]表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量（mgL）優(yōu)缺點研究現(xiàn)狀大腸桿菌酵母菌黑腹果蠅細(xì)胞植物動物60150055120種子干重的1%1000無生物活性產(chǎn)量低培養(yǎng)條件簡便生長迅速但不可表達(dá)全長蛋白純化昂貴表達(dá)穩(wěn)定不殺死細(xì)胞有活性但產(chǎn)量低成本高有活性成本低有活性成本低產(chǎn)量高未進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)未進(jìn)入商業(yè)應(yīng)用未進(jìn)入商業(yè)應(yīng)

4、用正在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因水稻的研發(fā)大動物牛、羊乳腺生物反應(yīng)器的研制上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究所自二十世紀(jì)九十年代初期就開展了乳腺生物反應(yīng)器研究工作，建立了體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)平臺，已成功獲得轉(zhuǎn)有人轉(zhuǎn)鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因克隆牛。然而，在乳腺生物反應(yīng)器研發(fā)過程中，外源基因表達(dá)的不高和整合位點的多樣化一直制約著乳腺生物反應(yīng)器的研發(fā)進(jìn)上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文3第一章人轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育及TF表達(dá)的檢測第一章人轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育及T

5、F表達(dá)的檢測人轉(zhuǎn)鐵蛋白（HumanTransferrin）是能與鐵結(jié)合的蛋白家族成員之一，而鐵是生命體中不可缺少的元素，是人體中最豐富的過渡金屬。在生物體中鐵離子與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，然后與細(xì)胞表面的受體形成復(fù)合物，通過細(xì)胞內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，如果人體內(nèi)轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏及突變，都可引起疾病。目前在增生細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的表面上均發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，臨床上，可通過注射轉(zhuǎn)鐵蛋白，或者利用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)藥物到特定的腫瘤部位，對一些疾病的治療具有實際意義。

6、然而由于天然的轉(zhuǎn)鐵蛋白含量少，而且血源的困難，及有感染危險，因此利用基因工程技術(shù)讓人轉(zhuǎn)鐵蛋白基因在宿主中高效表達(dá)，其具有很高的醫(yī)學(xué)和經(jīng)濟(jì)價值及應(yīng)用前景。本研究所構(gòu)建了乳腺特異啟動子——山羊β酪蛋白（P1A3）調(diào)控的人轉(zhuǎn)鐵蛋白（humantransferrinTF)表達(dá)質(zhì)粒，通過顯微注法獲得數(shù)個轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠家系，但這些家系在后代的繁育過程中轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達(dá)卻出現(xiàn)了明顯得差異。通過普通PCR法檢測陽性轉(zhuǎn)基因小鼠，將獲得的陽性轉(zhuǎn)基因小鼠與

7、正常的小鼠交配繁育后代。并在繁育過程中獲取小鼠的乳汁，通過酶連免疫吸附法檢測TF的表達(dá)量，從中篩選TF表達(dá)量高的轉(zhuǎn)基因小鼠傳代培育。進(jìn)而為下一步研究不同表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因小鼠整合位點的旁側(cè)序列及外源基因的拷貝數(shù)奠定基礎(chǔ)。1.1人轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的傳代及鑒定人轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的傳代及鑒定1.1.1材料材料本課題使用的P1A3TFneo小鼠是本實驗室顏景斌博士[8]等先前構(gòu)建的山羊β酪蛋白乳腺特異啟動子（簡稱P1A3）攜帶人轉(zhuǎn)鐵蛋白基因載