團頭魴鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因在嗜水氣單胞菌感染過程中的免疫功能研究.pdf

1、鐵是生物體不可缺少的微量元素，在多種生理活動中都發(fā)揮著重要作用，然而鐵過剩不僅會刺激機體產(chǎn)生有害的自由基，還會利于體內(nèi)病原微生物的增殖。因此，維持機體鐵穩(wěn)態(tài)至關重要，其中鐵蛋白（Ferritin，F(xiàn)T）和轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin，TF）分別作為鐵儲存和轉(zhuǎn)運蛋白而發(fā)揮著關鍵作用。一直以來，鐵是細菌和宿主爭奪營養(yǎng)源的核心，許多鐵代謝相關基因都會參與宿主的先天性免疫反應。近年來，鐵代謝通路的免疫功能研究越來越受關注，相關報道也逐漸增多

2、。團頭魴（Megalobrama amblycephala）作為我國的一種大宗淡水魚類，近年來由于集約化養(yǎng)殖和環(huán)境惡化等原因?qū)е露喾N病害頻發(fā)，其中以嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）感染引發(fā)的細菌性敗血癥尤為嚴重。本研究以團頭魴為研究對象，對其Ft（M.amblycephala ferritins，MamFers）和Tf(M.amblycephala transferrin，MamTf)基因進行了克隆、表達及

3、重組蛋白活性檢測，并在L8824細胞上過表達后進行數(shù)字表達譜測序及差異基因篩選，最后實驗驗證了MamFers和MamTf對鐵代謝和免疫通路的調(diào)控作用，旨在探索MamFers和MamTf基因在鐵代謝和免疫應答過程中發(fā)揮的作用，為魚類細菌性疾病的預防和治療及抗病育種提供理論依據(jù)。本文主要研究結(jié)果如下:
　　1.本研究克隆鑒定了團頭魴Ft基因兩個亞基(M.amblycephala ferritin Hand Msubunits，MamF

4、erH和MamFerM)，序列分析表明這兩個亞基都含有哺乳動物鐵蛋白H亞基的鐵氧化酶活性中心結(jié)構，而且MamFerM還含有哺乳動物鐵蛋白L亞基的成核作用位點。MamFerH和MamFerM的5非編碼區(qū)(5'-Untranslated Regions，5'-UTR)都含有鐵反應元件(Iron Responsive Element,IRE)元件，但預測的二級結(jié)構存在差異。序列比對分析表明MamFerH和MamFerM間的同源性僅有65％，并

5、且進化分析表明鐵蛋白H和M亞基分別聚為一支，表明兩者由不同的基因編碼而成。MamFerH和MamFerM具有類似的早期發(fā)育表達模式，都在出膜后表達上調(diào)。然而，MamFerH和MamFerM具有不同的組織表達模式，MamFer主要表達于血液和腦，而MamFerM則在脾臟、肝臟和腎臟中高表達。嗜水氣單胞菌感染后，MamFerH和MamFerM在mRNA和蛋白水平都能被誘導而顯著上調(diào)表達，免疫組化和免疫熒光分析表明感染后兩者在細胞質(zhì)和細胞核上

6、的分布都會顯著增強，其中MamFerH具有更快速和更顯著的急性期反應。相比之下，重組MamFerH蛋白也表現(xiàn)出更有效的抑菌作用，而重組MamFerM蛋白則具有更有效的鐵結(jié)合活性。
　　2.本研究還克隆了MamTf基因，MamTf蛋白由兩個同源結(jié)構域（N端和C端）組成，每個結(jié)構域都含有4個鐵離子結(jié)合位點。MamTf在團頭魴肝臟中特異性高表達，表達水平顯著高于其他組織。發(fā)育期表達分析顯示MamTf在12 hpf(hours post

7、fertilization)開始表達并逐漸上調(diào)，隨后在出膜期(32 hpf)顯著下調(diào)，出膜后在2 dph(days post hatching)顯著上調(diào)并達到最大值。嗜水氣單胞菌感染后MamTf及其受體1在團頭魴肝、脾、腎3個組織中的mRNA和蛋白表達水平都被誘導上調(diào)。普魯士藍染色顯示感染后肝細胞內(nèi)的鐵含量顯著增多，免疫組化分析表明感染后MamTf及其受體1在肝細胞膜和胞內(nèi)分布增多，表明兩者可能通過內(nèi)在化將鐵離子轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)，致使團頭魴肝

8、細胞內(nèi)鐵含量上調(diào)。重組MamTf蛋白的鐵結(jié)合活性呈現(xiàn)出濃度依賴性上升方式，并且體外實驗表明添加重組MamTf蛋白可以在一定程度上抑制嗜水氣單胞菌的增殖。
　　3.為進一步研究MamFers和Mam Tf基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，本研究在L8824細胞中過表達MamFerH、MamFerM和MamTf后進行數(shù)字表達譜測序。比較數(shù)字表達譜分析表明MamFerH和MamFerM的下游調(diào)控通路包括免疫系統(tǒng)及抗菌反應，qRT-PCR（Quanti

9、tative Real-time Polymerase Chain Reaction）驗證表明MamFers和MamTf過表達后分別能誘導TNFα(Tumor Necrosis Factor alpha)和iNOS（Inducible Nitric Oxide Synthase）基因表達上調(diào)。NFκB(Nuclear Factorκ B)作為一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，廣泛參與機體免疫應答，包括對多種細胞因子的表達調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)Mam

10、Fers和MamTf過表達后能促進NFκB的轉(zhuǎn)錄活性及pIKK蛋白磷酸化水平的上調(diào)。添加BAY11-7082（IκBα抑制劑）會顯著抑制MamFers和Mam Tf過表達后對細胞因子的誘導表達作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)MamFers和MamTf過表達后也能顯著上調(diào)MAPK(Mitogen-activated ProteinKinase)蛋白的磷酸化水平，添加U0126（MEK1/2抑制劑）會顯著抑制MamFers和Mam Tf過表達后對促炎

11、細胞因子的誘導表達作用。上述結(jié)果表明，MAPK和NFκB能介導MamFers和MamTf對促炎細胞因子的表達調(diào)控。
　　4.本研究發(fā)現(xiàn)MamFers和MamTf過表達會抑制嗜水氣單胞菌Ah對EPC細胞的粘附，而干擾后會促進Ah的粘附過程。qRT-PCR分析表明MamFers和MamTf過表達后ECM(Extracellular Matrixc)相關基因fibronectin(FN)和Integrinbeta1(Intgβ1)表達都

12、會被調(diào)控。然而兩者具有截然相反地調(diào)控方式，MamFers和MamTf過表達后FN表達上調(diào)而Intgβ1下調(diào)，MamFers和MamTf干擾后表達趨勢相反。進一步研究表明，F(xiàn)N和Intgβ1都參與了介導MamFers和MamTf對Ah粘附過程的調(diào)控。
　　5.本研究發(fā)現(xiàn)MamFers和MamTf過表達會促進NLRC5(NOD-like ReceptorFamily CARD Domain Containing5)、β2M(β2 Mi

13、croglobulin)和MHCⅠ（MajorHistocompatibility Complex ClassⅠ）表達上調(diào)。本研究將siRNA-NLRC5與MamFers和Mam Tf過表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后可以顯著抑制MamFers和MamTf對β2M/MHCⅠ表達的誘導作用，表明MamFers和Mam Tf可以通過NLRC5調(diào)控β2M/MHCⅠ的表達。此外，MamFers和Mam Tf過表達會顯著促進hepcidin基因表達上調(diào)，而siR