轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的CPT-PAMAM-PEG.pdf

1、惡性腫瘤已經(jīng)成為威脅人類健康和生命的最主要疾病之一,其發(fā)病率每年新增近1千萬例。近幾年對腫瘤生理深入的探索,促進(jìn)了腫瘤診斷和治療的發(fā)展,其死亡率有所下降。目前腫瘤的治療手段包括手術(shù)治療,放療和化療等,放化療在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也能殺死正常細(xì)胞,給病人帶來嚴(yán)重的毒副作用。因此研制更有效地靶向腫瘤細(xì)胞的給藥系統(tǒng)顯得尤為迫切。被動(dòng)靶向釋藥系統(tǒng)成功利用腫瘤的生理特征使載藥系統(tǒng)通過EPR效應(yīng)在腫瘤部位蓄積。藥物聚合物納米載體系統(tǒng)由于其良好的可調(diào)控

2、性、易于表面修飾、較高的藥物包封率、較強(qiáng)的藥物保護(hù)作用和適于大規(guī)模生產(chǎn),已成為研究熱點(diǎn)之一。雖然被動(dòng)靶向釋藥奠定了靶向給藥臨床治療的基礎(chǔ),但仍存在難以克服一些問題,如并不是所有的腫瘤都能體現(xiàn)出EPR效應(yīng),腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥現(xiàn)象使部分藥物不能有效地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞等等。要克服這些困難,則需要使載藥系統(tǒng)主動(dòng)地靶向腫瘤細(xì)胞,主動(dòng)靶向可以通過與細(xì)胞表面特定的受體相結(jié)合的配體或抗體來實(shí)現(xiàn)。
　　 本課題通過藥劑學(xué)、高分子材料學(xué)、藥理學(xué)、分子生

3、物學(xué)等手段的交叉應(yīng)用,以喜樹堿(CPT)為模型藥物,轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)為靶向頭基,首先制備載CPT的主動(dòng)靶向隱形納米載藥系統(tǒng),將聚乙二醇(PEG)修飾的被動(dòng)靶向與Tf修飾的主動(dòng)靶向作用相結(jié)合,有效遞送藥物到達(dá)腫瘤部位。
　　 本課題以琥珀酸酐為連接劑,首先合成了琥珀酰喜樹堿酯,并用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化。用帶有雙功能基團(tuán)的NHS-PEG-MAL分子上的NHS端與PAMAM上的氨基相連,合成了三種不同PEG化程度的PAMA

4、M-PEG(PP16,PP32和PP48),通過1HNMR計(jì)算PAMAM所連接的PEG數(shù)量并測定了粒徑和Zeta電位。喜樹堿琥珀酸活化酯與PAMAM表面剩余的氨基共價(jià)連接,合成了CPT-PAMAM-PEG納米載藥系統(tǒng)(CPP16,CPP32和CPP48)。藥物的體外釋放顯示出緩釋的特性(120小時(shí)內(nèi)累積釋放75％)。用Traut's試劑將轉(zhuǎn)鐵蛋白巰基化,合成了轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的主動(dòng)靶向載藥納米復(fù)合物CPT-PAMAM-PEG-Tf(CPP1

5、6T,CPP32T和CPP48T),采用bradford法測得平均每個(gè)PAMAM復(fù)合物連接1分子轉(zhuǎn)鐵蛋白。連接轉(zhuǎn)鐵蛋白后復(fù)合物的粒徑增加了近一倍,Zeta電位由正負(fù)。轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的CPT復(fù)合物較CPT原料藥和未經(jīng)轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的復(fù)合物對KB,K562和S180細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤活性。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的PAMAM-PEG復(fù)合物在KB、K562細(xì)胞中的攝取量分別為未經(jīng)Tf修飾復(fù)合物的3.38～3.46倍和2.52～2.86倍。

6、實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的PAMAM-PEG復(fù)合物在KB細(xì)胞中的攝取具有濃度依賴性,且轉(zhuǎn)鐵蛋白可以明顯抑制復(fù)合物的攝取,說明其通過細(xì)胞表面高表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。
　　 以異硫氰酸羅丹明B(RBITC)為熒光標(biāo)記物,合成了帶熒光標(biāo)記物的RPP和RPPT。采用各種內(nèi)吞抑制劑對復(fù)合物的內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)行了初步探討,結(jié)果顯示RPP48和RPP48T都是由細(xì)胞表面的網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞,RPP48T以細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞為

7、主。用Lysotrackergreen對細(xì)胞溶酶體進(jìn)行染色,激光共聚集顯微鏡觀察表明復(fù)合物內(nèi)吞后經(jīng)溶酶體途徑轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 采用Hochest和PI雙染對低濃度CPT復(fù)合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究發(fā)現(xiàn),CPT,CPP48和CPP48T12h誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡率分別為0.76％,2.41％和4.63％,24h分別為4.75％,16.02％和30.91％。說明CPP48T被腫瘤細(xì)胞攝取最多,誘導(dǎo)凋亡的效果最好。
　　 大鼠體內(nèi)藥動(dòng)

8、學(xué)顯示復(fù)合物中PEG化程度越大,復(fù)合物在體內(nèi)的半衰期和平均滯留時(shí)間越長,AUC也越大,但是經(jīng)轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的復(fù)合物較未經(jīng)Tf修飾的復(fù)合物的半衰期短。S180荷瘤小鼠體內(nèi)的組織分布結(jié)果表明CPP48T給藥后藥物在腫瘤內(nèi)的達(dá)峰濃度最高,分別是CPT和CPP48的8.4和2.7倍,AUC分別是CPT和CPP48的28.7和3.6倍。CPP48T的相對靶向效率最高(28.7),顯示CPP48T的腫瘤靶向性最強(qiáng)。
　　 對S-180荷瘤小鼠