依達拉奉對慢性腦低灌注大鼠腦自由基代謝及海馬CA1區(qū)HIF-1α表達的影響.pdf

1、目的：慢性腦低灌注狀態(tài)是是血管性癡呆(vasculardementia，VD)、Alzheimer's病(AD)和Binswanger病等多種疾病發(fā)展過程中的一個共同病理過程。在我國，VD是老年期癡呆的主要組成部分。VD不僅嚴重損害患者的健康，也給社會和家庭帶來沉重的負擔。目前，VD的發(fā)病機制尚不十分清楚，也無特殊有效的治療方法，因此探討VD的發(fā)病機理，制定合理的治療方案，是醫(yī)學領域研究的重要課題。 目前認為慢性腦低灌注是VD的

2、主要原因。有研究表明，在低灌注狀態(tài)及低代謝狀態(tài)下認知功能可發(fā)生減退，而腦部自由基代謝的紊亂是低灌注時產生腦實質和腦微血管系統(tǒng)損害的重要的可能機制。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)作為體內清除超氧陰離子的特異酶，其變化間接反應了體內清除自由基的能力變化。丙二醛(malondialdehyde，MDA)是脂質過氧化反應的代謝終產物，間接反應了體內自由基損傷引起的脂質過氧化反應的強弱。腦缺血后脂質過氧化活躍，M

3、DA產生增多，SOD則因消耗增多而減少。缺氧誘導因子-1a(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是近幾年發(fā)現(xiàn)的參與調節(jié)氧穩(wěn)態(tài)失衡的一個核心調節(jié)因子，在低氧狀況下誘導產生并發(fā)揮多方面效應。有研究表明，HIF-1α可能參與了慢性低灌注大鼠的代償與適應機制。依達拉奉作為一種氧自由基清除劑對急性腦缺血的神經保護作用引起了人們越來越多的關注。但國內外有關依達拉奉神經保護作用的大部分研究都集中在急性缺血模型，有關依

4、達拉奉作用于慢性腦缺血模型的實驗研究報道尚缺乏。本實驗通過模擬人類慢性腦低灌注的大鼠動物模型，觀察大鼠學習記憶、前腦組織SOD活力和MDA含量及海馬CA1區(qū)HIF-1a的表達變化并觀察新型自由基清除劑依達拉奉對它們的影響，在揭示了VD發(fā)病機制的同時也為臨床治療血管性認知功能障礙提供一個新的思路。 方法：雄性SD大鼠84只，月齡3-4個月，體重280～340g，隨機分為假手術對照組(n=20)，生理鹽水組(n=32)，依達拉奉組(

5、n=32)。各組又隨機分為6周組和8周組。生理鹽水組和依達拉奉組大鼠按照de la Torre等[1]方法，行雙側頸總動脈永久結扎術，假手術組大鼠除不結扎雙側頸總動脈外，余處理同生理鹽水組和依達拉奉組。依達拉奉組手術第4周后腹腔注射依達拉奉5mg·kg-1·d-1，六周組共注射2周，八周組共注射4周，生理鹽水組腹腔注射等劑量生理鹽水。各組大鼠術后分別在各時間點水迷宮測試后斷頭在冰盤上快速取腦，去除腦干及小腦，置0～4℃生理鹽水中漂洗，除

6、去血液，濾紙拭干。視交叉后1mm及4mm冠狀切開腦組織，取中間切塊為海馬組織，系列固定、脫水、浸蠟、包埋制成石蠟切片，行HE染色和免疫組化染色觀察海馬病理變化和HIF-1a表達變化，運用Image-Pro Plus圖象分析軟件對各組大鼠海馬組織CAl區(qū)相同面積內HIF-1a陽性細胞測定累計光密度(IOD)。取視交叉前腦組織分別檢測SOD活力和MDA含量。運用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，采用LSD-t檢驗進行各組間的兩兩

7、比較，P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。 結果：(1)各組大鼠存活情況：假手術組(包括6周組和8周組)死亡0只，生理鹽水6周組、8周組分別死亡5只、6只，死亡率分別為31.3％和37.5％。依達拉奉6周組、8周組分別死亡5只、4只，死亡率分別為3 1.3％和25％。各組存活大鼠作為研究對象。(2)水迷宮試驗：生理鹽水6周組、生理鹽水8周組大鼠學習、記憶成績顯著下降，表現(xiàn)為尋找平臺潛伏期時間延長，明顯高于假手術組(P＜0.05)，與生

8、理鹽水6周組相比，生理鹽水8周組大鼠學習、記憶成績下降更明顯(P＜0.05)。依達拉奉6周組、8周組分別與生理鹽水6周組、8周組比較，學習、記憶成績均顯著改善(P＜0.05)，與假手術6周組相比，依達拉奉6周組學習、記憶成績仍有所下降(P＜0.05)，依達拉奉8周組與假手術8周組相比學習、記憶成績無顯著差別(P＞0.05)，與依達拉奉6周組相比，依達拉奉8周組學習、記憶成績有所改善(尸＜0.05)。(3)海馬HE染色：假手術組大鼠海馬C

9、Al區(qū)錐體細胞排列較致密整齊，胞漿內尼氏體豐富，核大而圓，核仁明顯；相比之下，生理鹽水組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列松散，層次不清，有細胞缺失現(xiàn)象，出現(xiàn)炎性細胞浸潤，胞體變小，核固縮，胞質濃染，且8周組較6周組細胞缺失、核固縮現(xiàn)象更明顯；依達拉奉組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列尚整齊，層次尚清，炎性細胞浸潤明顯減少，核固縮現(xiàn)象較少見，且8周組較6周組改善更明顯。(4)海馬CA1區(qū)HIF-1a表達變化：假手術組海馬CA1區(qū)僅見極少量陽性神經

10、元；生理鹽水6周組、8周組可見少量陽性神經元，排列松散，胞體變小，核固縮，陽性細胞累計光密度(IOD)值高于假手術組(P＜0.05)；生理鹽水6周組與8周組比較IOD值差異無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；依達拉奉6周組、8周組海馬CA1區(qū)均可見有大量HIF-1α陽性神經元分布，陽性物質主要位于胞漿內，胞核也有少量表達，細胞排列較整齊緊密，呈棕黃色，胞體較大，圓形或橢圓形，有的可見突起；與假手術6周組及生理鹽水6周組相比，依達拉奉6周組陽性

11、神經元IOD值明顯增高(P＜0.01)；與假手術8周組及模型8周組相比，依達拉奉8周組陽性神經元IOD值明顯增高(P＜0.01)，且亦高于依達拉奉6周組(P＜0.05)。(5)SOD、MDA測定結果情況：與假手術組相比，生理鹽水6周組、8周組前腦組織SOD活力下降，MDA含量增加(P＜0.05)。生理鹽水6周組與8周組相比，生理鹽水8周組SOD活力下降進一步下降，MDA含量進一步增加(P＞0.05)；與生理鹽水6周組相比，依達拉奉6周組

12、SOD活力有所增加，MDA含量有所下降(P＜0.05)。與生理鹽水8周組相比，依達拉奉8周組SOD活力明顯增加，MDA含量明顯下降(P＜0.01)，且與依達拉奉6周組相比SOD活力亦有所增加，MDA含量有所下降(P＜0.05)。 結論：(1)本實驗成功地建立了慢性腦低灌注大鼠模型(2-VO)，水迷宮試驗證實了模型大鼠存在學習和記憶功能障礙，海馬HE染色顯示錐體細胞受損能夠基本模擬臨床上VD的智能障礙，同時，也證實了依達拉奉的治療

13、效果。(2)采用免疫組織化學方法，證實了在慢性腦低灌注狀態(tài)下大鼠海馬組織HIF-1α表達增加，可能參與了慢性腦缺血的代償與適應機制。分別采用黃嘌呤氧化法和硫代巴比妥酸顯色法測定2-VO大鼠前腦組織SOD活性及MDA含量，證實了2-VO后腦組織SOD活性下降，MDA含量增加。依達拉奉治療后大鼠海馬組織HIF-1α表達明顯增加，前腦組織SOD活性明顯增強，MDA含量明顯下降，表明依達拉奉可能通過促進HIF-1α表達，抑制黃嘌呤氧化酶和次黃嘌