依達(dá)拉奉對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織水通道蛋白9mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、目的：⑴本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)建立重復(fù)性強(qiáng)、穩(wěn)定的大鼠大腦中動(dòng)脈永久性缺血?jiǎng)游锬Ｐ停⒃诖嘶A(chǔ)上進(jìn)行神經(jīng)功能、腦梗死體積、腦組織含水量、病理學(xué)改變及水通道蛋白-9(AQP9)mRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)變化的觀察，進(jìn)而探討分析大鼠腦缺血損傷中AQP9mRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)與腦水腫之間的關(guān)系以及AQP9在腦缺血損傷中的作用。⑵通過(guò)依達(dá)拉奉對(duì)腦缺血大鼠腦組織中AQP9mRNA表達(dá)變化的研究，進(jìn)而探討依達(dá)拉奉在腦缺血損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制，為急性缺血性腦血管病的臨床治

2、療提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：采用成年雄性Sprague-Dawley大鼠252只，隨機(jī)分成假手術(shù)組、鹽水組、依達(dá)拉奉組，每組84只，每組再按術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d七個(gè)時(shí)間點(diǎn)分成7小組，每組12只。采用改良線栓法，用尼龍線對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞，建立永久性腦缺血大鼠動(dòng)物模型。建模后用Longa神經(jīng)功能評(píng)分方法和Berderson神經(jīng)功能評(píng)分方法對(duì)每只大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，1～3分大鼠進(jìn)入研究中。試驗(yàn)中缺失的大鼠

3、要隨機(jī)補(bǔ)充，保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量不變。在依達(dá)拉奉組，每只大鼠以依達(dá)拉奉腹腔注射，劑量為每公斤體重3mg，每12h給藥一次；生理鹽水組給等劑量的生理鹽水；假手術(shù)組不給藥。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，隨機(jī)從每小組中選取6只模型動(dòng)物，處死并快速取出大腦。冠狀切去嗅球和額極4mm組織，前額3mm厚腦組織用于腦含水量測(cè)定，按照干濕重法公式：(濕重―干重)/濕重×100%，測(cè)量腦含水量的百分比。剩下的后半部分用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)AQP9mRNA的表達(dá)水平。

4、余下的6只模型被處死，暴露出心臟，用生理鹽水200ml左心室灌注。以前囟為中心，2mm厚冠狀切取腦片6片，第3片用于組織學(xué)檢查，予以4%甲醛固定，不同濃度乙醇脫水，石蠟包埋等處理，以每片5μm厚連續(xù)冠狀切片。余下的5張腦片用TTC染色來(lái)觀察腦梗死體積改變。結(jié)果：⑴本實(shí)驗(yàn)用線栓法制作的局灶性腦缺血模型穩(wěn)定可靠，重復(fù)性強(qiáng)。⑵術(shù)后進(jìn)行神經(jīng)缺損評(píng)分發(fā)現(xiàn)，由于麻醉和手術(shù)創(chuàng)傷的影響，假手術(shù)組術(shù)后出現(xiàn)6～24h神經(jīng)功能減退。與假手術(shù)組相比，在6h～2

5、4h時(shí)間段鹽水組神經(jīng)功能下降明顯(p<0.05)。依達(dá)拉奉組神經(jīng)功能明顯好于鹽水組(p<0.05)。術(shù)后7天鹽水組和依達(dá)拉奉組神經(jīng)功能基本恢復(fù)。⑶術(shù)后6h～7d假手術(shù)組腦水含量幾乎沒(méi)有變化，鹽水組腦含水量增加明顯，術(shù)后48h到達(dá)高峰，明顯高于依達(dá)拉奉組(p<0.05)。⑷在術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)鹽水組中腦缺血周?chē)M織AQP9mRNA相對(duì)假手術(shù)組表達(dá)明顯上調(diào)(p<0.05)。在鹽水組和依達(dá)拉奉組中，腦缺血后6h腦缺血周邊A

6、QP9mRNA表達(dá)開(kāi)始逐漸上調(diào)，72h到達(dá)高峰，而后開(kāi)始下調(diào)，至7d兩組表達(dá)水平仍高于假手術(shù)組；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)鹽水組和依達(dá)拉奉組AQP9mRNA表達(dá)水平均明顯高于假手術(shù)組(p<0.05)；AQP9mRNA表達(dá)水平與腦含水量相一致，相關(guān)性分析顯示二者密切相關(guān)(r=0.788，p<0.05)。⑸在依達(dá)拉奉組和鹽水組中，缺血24h腦梗死體積最大；與鹽水組相比，術(shù)后6～24h依達(dá)拉奉組腦梗死體積明顯減小(p<0.05)。⑹HE染色顯

7、示術(shù)后6h在腦缺血區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞無(wú)明顯改變，6h后缺血區(qū)腦組織逐漸出現(xiàn)腫脹與壞死；在依達(dá)拉奉組，腦水腫和神經(jīng)元壞死病理?yè)p害明顯較輕，在假手術(shù)組腦組織無(wú)明顯改變。結(jié)論：⑴本實(shí)驗(yàn)采用大鼠中動(dòng)脈線栓法，成功地建立了穩(wěn)定的局灶性腦缺血大鼠動(dòng)物模型，重復(fù)性強(qiáng)，此模型接近臨床腦缺血發(fā)生過(guò)程，適于急性實(shí)驗(yàn)研究。⑵鹽水組中AQP9mRNA表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，且AQP9mRNA表達(dá)水平與腦水含量存在時(shí)間上的相關(guān)性。表明AQP9mRNA表達(dá)水平與缺血后

8、腦水腫的形成密切相關(guān)。提示AQP9可能在腦缺血后腦水腫的形成和繼發(fā)損傷中產(chǎn)生重要作用。⑶依達(dá)拉奉組中腦梗死周邊組織腦含水量和AQP9mRNA水平與鹽水組相比降低明顯；依達(dá)拉奉作為自由基清除劑能有效地抑制AQP9mRNA表達(dá)和改善腦水腫。提示依達(dá)拉奉可能是通過(guò)抑制AQP9mRNA表達(dá)和改善腦水腫發(fā)揮腦保護(hù)作用。AQP9mRNA表達(dá)水平的調(diào)節(jié)和修飾將成為防止腦水腫及減輕卒中后腦損害新的策略。通過(guò)調(diào)節(jié)AQP9mRNA表達(dá)的方法可能為治療腦缺血