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文檔簡(jiǎn)介
1、足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白分子是腎小球?yàn)V過(guò)屏障結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分,研究證實(shí),nephrin、podocin、synaptopodin等足細(xì)胞蛋白分子與蛋白尿形成密切相關(guān),成為闡明原發(fā)性腎病綜合征發(fā)病機(jī)制和研發(fā)藥物靶點(diǎn)的熱點(diǎn)。本課題組前期采用基因芯片技術(shù)對(duì)原發(fā)性微小病變型(MCD)腎病綜合征患兒的腎組織基因表達(dá)譜進(jìn)行分析篩選,發(fā)現(xiàn)患兒腎組織中血管生成素樣蛋白3(ANGPTL3)表達(dá)水平明顯升高,隨后在阿霉素大鼠模型中也發(fā)現(xiàn)了類似的情況。進(jìn)一
2、步的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ANGPTL3可影響足細(xì)胞與基底膜(GBM)的黏附穩(wěn)定,還能夠引發(fā)足細(xì)胞骨架重排。以上提示ANGPTL3可能是影響足細(xì)胞裂孔隔膜結(jié)構(gòu)和功能的重要因子之一。
ANGPTL3是血管生成素家族的成員之一,分子量70KDa(人),主要由肝細(xì)胞合成,在正常狀態(tài)下腎組織僅有微量表達(dá)。其生物學(xué)功能有促進(jìn)血管生成和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,以往對(duì)于ANGPTL3的研究主要集中于脂質(zhì)代謝,研究發(fā)現(xiàn)它可以通過(guò)抑制脂酶活性,導(dǎo)致血脂升高,尤以
3、甘油三酯和低密度脂蛋白為主。近期研究發(fā)現(xiàn),ANGPTL3可以通過(guò)和血管內(nèi)皮整合素β3受體結(jié)合來(lái)發(fā)揮其調(diào)節(jié)血管生成的生物學(xué)作用,整合素β3成為ANGPTL3的主要受體。本課題組前期的體外研究也發(fā)現(xiàn)ANGPTL3可以在腎小球足細(xì)胞中與整合素β3存在共定位關(guān)系,并通過(guò)激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路導(dǎo)致足細(xì)胞骨架重排,表明整合素β3是ANGPTL3在腎臟的重要下游受體;進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)ANGPTL3低表達(dá)可保護(hù)足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)在阿霉素?fù)p傷時(shí)的相對(duì)完整性。我
4、們前期的研究充分的提示ANGPTL3與腎病時(shí)足細(xì)胞功能和蛋白尿的變化有密切的關(guān)系,但尚需整體水平上進(jìn)一步深入研究,即通過(guò)ANGPTL3表達(dá)改變的動(dòng)物模型來(lái)考察ANGPTL3對(duì)腎臟結(jié)構(gòu)和功能的影響。
體內(nèi)精原細(xì)胞介導(dǎo)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法較傳統(tǒng)方法獲得轉(zhuǎn)基因子代周期短,制作過(guò)程簡(jiǎn)單,不需要特殊的儀器。據(jù)報(bào)道,通過(guò)這種方法,F0代精子中目的基因穩(wěn)定表達(dá)長(zhǎng)達(dá)一年余,第一代轉(zhuǎn)基因仔鼠可以在手術(shù)后60天左右可以獲得,鑒定陽(yáng)性率可高達(dá)60%
5、。本課題擬通過(guò)精原細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備ANGPTL3表達(dá)上調(diào)和下調(diào)小鼠模型,考察ANGPTL3表達(dá)變化對(duì)小鼠腎臟功能及足細(xì)胞的影響;進(jìn)一步在ANGPTL3表達(dá)上調(diào)和下調(diào)轉(zhuǎn)基因小鼠模型的基礎(chǔ)上,制備阿霉素腎病小鼠模型,觀察ANGPTL3表達(dá)變化在阿霉素作用下對(duì)小鼠腎臟功能及足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響,深入探討ANGPTL3對(duì)腎臟產(chǎn)生影響的可能機(jī)制,為腎病綜合征發(fā)病機(jī)制的研究及治療靶點(diǎn)的研發(fā)提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)研究依據(jù)。
第一部分ANGPTL
6、3表達(dá)變化的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備與鑒定及其對(duì)腎臟的影響
目的通過(guò)精原細(xì)胞介導(dǎo)的動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備ANGPTL3表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的小鼠模型,了解ANGPTL3對(duì)小鼠腎臟功能及足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響,建立簡(jiǎn)易有效的動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺(tái)。方法(1)制備和線性化ANGPTL3重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ANGPTL3和小干擾質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-ANGPTL3-miRNA;各取4周齡Balb/C雄性小鼠20只和昆明系(KM)雄性
7、小鼠10只,分別將這二種線性化質(zhì)粒20ul(0.5ug/ul)注射入右側(cè)睪丸內(nèi),電穿孔后復(fù)位,同時(shí)結(jié)扎摘除左側(cè)睪丸(F0代);(2)分別于術(shù)后1、3、6和12月取2只注射pcDNA6.2-GW/EmGFP.ANGPTL3-miRNA質(zhì)粒的Balb/C雄鼠的睪丸,觀察睪丸轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況,了解FO代小鼠睪丸中目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的情況;(3)術(shù)后35天分別與野生型雌鼠合籠交配,所產(chǎn)子代(F1代)以特異性引物PCR鑒定其基因型后,
8、分為3組:ANGPTL3上調(diào)組(AT,ANGPTL3transgenetic)、ANGPTL3干擾組(AR,ANGPTL3RNAi)和野生型組(WT,wild-type)。每組各取5只6周齡小鼠,ELISA法檢測(cè)血清中ANGPTL3水平,通過(guò)Real-timePCR、免疫組化、Westernblot檢測(cè)肝臟和腎皮質(zhì)ANGPTL3表達(dá),以腎臟表達(dá)情況驗(yàn)證ANGPTL3上調(diào)和干擾效率;觀察各組間小鼠表型變化;(4)檢測(cè)24小時(shí)尿蛋白定量和血
9、脂(甘油三酯和膽固醇)水平,觀察腎小球結(jié)構(gòu)形態(tài);TUNEL法檢測(cè)腎小球細(xì)胞凋亡情況;Real-timePCR、免疫組化和Westernblot檢測(cè)腎皮質(zhì)中integirn-β3、nephrin、podocin、WT1、VEGF、LXR和synaptopdin的表達(dá)。
結(jié)果(1)雄鼠睪丸注射及電穿孔手術(shù)成功率100%,術(shù)后雄鼠在適宜環(huán)境下一月內(nèi)全部恢復(fù)正常狀態(tài);FO代Balb/C雄鼠術(shù)后1、3、6月,睪丸中仍表達(dá)GFP,3月時(shí)表
10、達(dá)最強(qiáng),但有逐漸減弱的趨勢(shì),術(shù)后12月消失;Balb/C和KMF0代小鼠術(shù)后各有11只(55.O%)和10只(100%)產(chǎn)有子代;(2)基因組PCR鑒定Fl代子鼠共298只,陽(yáng)性小鼠134只(44.9%),其中AT組50.O%(66/132),AR組40.9%(68/166);Balb/C和KMF1代小鼠PCR鑒定陽(yáng)性率分別為40.0%和60.3%;AR組和AT組小鼠在外觀、活動(dòng)、性格等方面無(wú)明顯差異;(3)小鼠血清中ANGPTL3水平
11、:Balb/C小鼠中,AT組(32.5±2.0ug/ml)明顯高于AR組(20.2±2.1ug/ml)和WT組(25.2±1.7ug/ml),AR組明顯低于WT組(均P<0.05);KM系小鼠中,AT組(40.4±2.2ug/ml)明顯高于AR組(34.5±4.5ug/ml)(P=0.038),但與WT組(39.5±4.0ug/ml)無(wú)明顯差異;Balb/C小鼠中肝臟和腎皮質(zhì)ANGPTL3表達(dá)及mRNA水平:AT組>WT組>AR組,其中
12、AT組明顯高于AR組(均P<0.05)。以腎小球中ANGPTL3的表達(dá)變化為標(biāo)準(zhǔn),AT組小鼠ANGPTL3上調(diào)的效率約為65.5%,AR組小鼠ANGPTL3下調(diào)的效率約為31.2%;(4)Balb/C小鼠血清甘油三酯水平:AT組>WT組>mR組,AT組明顯高于AR組(P=0.040);膽固醇三組間無(wú)明顯變化;AT組體重明顯低于AR組和WT組(P<0.001);Balb/C小鼠24小時(shí)尿蛋白定量、腎小球形態(tài)學(xué)和細(xì)胞凋亡水平三組間無(wú)明顯差異
13、;Balb/C小鼠腎皮質(zhì)整合素β3、podocin、synaptopdin和VEGF表達(dá)及mRNA水平:AT組>WT組>AR組;而nephrin則相反,AR組>WT組>AT組;LXR和WT1表達(dá)在各組間無(wú)明顯差異。
小結(jié)成功地以體內(nèi)精原細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立ANGPTL3表達(dá)上調(diào)與下調(diào)轉(zhuǎn)基因小鼠模型,上調(diào)效率約為65.5%,下調(diào)效率約為31.2%。該方法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的子代陽(yáng)性率為44.9%;ANGPTL3上調(diào)可引起血清甘油
14、三酯水平升高,體重下降。同時(shí)ANGPTL3表達(dá)的變化可引起足細(xì)胞分子整合素β3、podocin、synaptopdin、VEGF和nephrin表達(dá)的變化。
第二部分體內(nèi)ANGPTL3表達(dá)改變對(duì)阿霉素腎病小鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能的影響及其機(jī)制
目的觀察ANGPTL3表達(dá)上調(diào)和下調(diào)對(duì)阿霉素作用下小鼠腎臟功能的影響,探討ANGPTL3對(duì)腎臟結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響的可能機(jī)制。
方法(1)于AT組(ANGPTL3表達(dá)上調(diào)效率
15、為65.5%,見(jiàn)第一部分)、WT組和AR組(ANGPTL3表達(dá)下調(diào)效率為31.2%,見(jiàn)第一部分)各取6周齡Balb/C雄鼠7只,尾靜脈注射阿霉素10.5mg/kg,分別命名為:A-AT、A-WT。和A-AR;對(duì)照組注射同等劑量生理鹽水,分別命名為:AT、AR和WT。分別于第1、2、4、6周收取24小時(shí)尿液,第6周處死,留取血清和腎臟標(biāo)本;(2)檢測(cè)指標(biāo)和方法同第二部分。
結(jié)果(1)阿霉素注射后,三組小鼠24小時(shí)尿蛋白于第2周開
16、始升高,其中,第2周時(shí)A-AR組低于A-WT組;第2周和第6周時(shí)A-AT組明顯高于A-AR組(P=0.026和0.035);第6周時(shí)血清甘油三酯水平阿霉素組均明顯高于對(duì)照組,其中A-AT組明顯高于A-AR組(P=0.028);膽固醇水平:在阿霉素組較對(duì)照組升高,其中A-AT組較AT組顯著升高(P=0.039),在阿霉素組內(nèi)A-AT組較A-AR.組和A-WT組升高,A-AR組低于A-WT組;(2)電鏡下阿霉素注射三組小鼠均出現(xiàn)大量腎小球足
17、突融合,其中,A-AT組較A-AR組和A-WT組小鼠足突融合更廣泛,而A-AR組較A-WT組足突融合程度輕;(3)TUNEL顯示阿霉素注射三組小鼠腎小球細(xì)胞凋亡均升高,其中A-AT組明顯高于A-AR組和A-WT組;(4)血清中ANGPTL3水平A-AT組較A-AR組、A-WT組和AT組均明顯升高(P=0.038和0.011);腎皮質(zhì)中ANGPTL3表達(dá)和mRNA水平A-AT組較A-WT組升高,A-AR組較A-WT組降低;(5)腎皮質(zhì)整合
18、素β3、synaptopdin和VEGF表達(dá)及mRNA水平A-AT組較A-AR組和A-WT組顯著升高,而nephrin和WT1則顯著降低,LXR在三組間無(wú)明顯差異。
小結(jié)ANGPTL3表達(dá)上調(diào)65%可使阿霉素腎病小鼠蛋白尿顯著升高,腎臟損傷更加嚴(yán)重;可使阿霉素腎病小鼠甘油三酯和膽固醇水平升高更顯著;可促進(jìn)阿霉素作用下腎小球細(xì)胞凋亡水平,可誘導(dǎo)更顯著的腎小球Synaptopdin、VEGF、整合素β3表達(dá)升高,以及nephrin
19、與WT1表達(dá)降低;ANGPTL3表達(dá)下調(diào)31.2%較野生型小鼠在阿霉素作用下尿蛋白的發(fā)生延遲,可以減輕因阿霉素?fù)p傷引起的足突融合;在腎臟結(jié)構(gòu)及足細(xì)胞蛋白分子表達(dá)等各方面無(wú)明顯差異。
結(jié)論
1.精原細(xì)胞介導(dǎo)的動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)較傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因及基因敲除技術(shù)簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì),易于操作。FO代雄鼠睪丸電轉(zhuǎn)質(zhì)粒后可穩(wěn)定表達(dá)6個(gè)月;F1代轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率約為45%;生殖能力及子代的轉(zhuǎn)基因鼠陽(yáng)性率與動(dòng)物品系的不同有關(guān),KM鼠高于Balb/C小
20、鼠;AT組小鼠ANGPTL3表達(dá)上調(diào)的效率約為65.5%,AR組小鼠ANGPTL3表達(dá)下調(diào)的效率約為31.2%。
2.ANGPTL3表達(dá)上調(diào)可引起小鼠甘油三酯升高,體重下降,引起腎臟足細(xì)胞蛋白分子整合素β3、podocin、synaptopdin、VEGF、nephrin等發(fā)生變化;ANGPTL3表達(dá)下調(diào)可使小鼠甘油三酯降低,足細(xì)胞各分子的變化與ANGPTL3表達(dá)上調(diào)時(shí)相反。
3.在阿霉素作用下,ANGPTL3表達(dá)上
21、調(diào)可使血清甘油三酯和膽固醇水平明顯升高,并引起更嚴(yán)重的腎臟足細(xì)胞的損傷,血脂、腎小球細(xì)胞凋亡水平及VEGF、整合素β3等升高更明顯,并且導(dǎo)致nephrin與WT1表達(dá)下降更顯著。
4.在阿霉素作用下,ANGPTL3表達(dá)下調(diào)31.2%較野生型小鼠尿蛋白發(fā)生延遲,血清膽固醇略低,可以保護(hù)足細(xì)胞的完整性,減輕因阿霉素?fù)p傷引起的足突融合;但腎臟足細(xì)胞各蛋白分子間,如整合素β3、podocin、synaptopdin、VEGF、neph
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