小鼠血管生成素-1慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、目的:構(gòu)建攜帶小鼠血管生成素-1(Angiopoietin-1，Ang-1)基因的慢病毒載體并對(duì)重組載體進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步研究通過(guò)Ang-1基因療法治療BPD提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 (1)以pcDNA-Ang-1為模板，采用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增前后端帶有attB重組位點(diǎn)的Ang-1全長(zhǎng)序列;
　　 (2)利用Gateway技術(shù)通過(guò)BP反應(yīng)構(gòu)建入門(mén)克隆pDown-Ang-1;
　　 (3)應(yīng)用PCR

2、及基因測(cè)序?qū)θ腴T(mén)克隆進(jìn)行鑒定;
　　 (4)通過(guò)LR反應(yīng)將pDown-Ang-1與質(zhì)粒pUp-CMV、pDown-An哥1、pTail-IRES/DsRed-Express2和母載體PLV.Des3d.P/puro進(jìn)行重組反應(yīng)，構(gòu)建攜帶DsRed熒光蛋白的Ang-1慢病毒表達(dá)載體PLV.Ex3d.P/puro-CMV＞Ang-1＞IRES/DsRed-Express2;
　　 (5)應(yīng)用PCR及基因測(cè)序?qū)Ρ磉_(dá)載體進(jìn)行鑒定

3、;
　　 (6)將PLV.Ex3d.P/puro-CMV＞Ang-1＞IRES/DsRed-Express2與輔助質(zhì)粒（pLV/he lper-SL3、pLV/helper-SL4及pLV/helper-SL5）采用脂質(zhì)體法共同轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的包裝，產(chǎn)生相應(yīng)的慢病毒顆粒，通過(guò)熒光表達(dá)情況來(lái)測(cè)定病毒滴度和感染效率。
　　 結(jié)果:PCR及基因測(cè)序證實(shí)，通過(guò)BP反應(yīng)成功構(gòu)建了入門(mén)克隆pDown-Ang-1，通過(guò)L

4、R反應(yīng)成功構(gòu)建了Ang-1慢病毒表達(dá)載體PLV.Ex3d.P/puro-CMV＞Ang-1＞IRES/DsRed-Express2，慢病毒表達(dá)載體全長(zhǎng)序列10621 bps，CMV啟動(dòng)子序列1950bp-2538bp，Ang-1開(kāi)放閱讀框架序列2569bp-4065bp，IRES序列4080bp-4677bp，DsRed-Express2序列4678bp-5355bp。與輔助質(zhì)粒（pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL

5、4及pLV/helper-SL5）采用脂質(zhì)體法共同轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)熒光的表達(dá)，且包裝出具高效感染力的慢病毒，根據(jù)熒光表達(dá)情況測(cè)定病毒滴度為5×108 TU/ml。
　　 結(jié)論:應(yīng)用Gateway技術(shù)成功構(gòu)建了Ang-1慢病毒表達(dá)載體PLV.Ex3d.P/puro-CMV＞Ang-1＞IRES/DsRed-Express2，并包裝出具高效感染力的慢病毒顆粒，為進(jìn)一步研究通過(guò)Ang-1基因療法治療BPD提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。