血管生成素-1、血管生成素-2及Tie2受體在人體血管瘤裸小鼠移植模型中的表達(dá).pdf

1、第一部分人血管瘤裸小鼠移植模型的建立和鑒定 背景和目的：嬰幼兒血管瘤是小兒最常見的良性腫瘤。大多數(shù)血管瘤可以自行消退而不需要進(jìn)行任何干預(yù)。但是大約有10％的血管瘤由于其生長(zhǎng)過(guò)于迅速或者生長(zhǎng)部位特殊而可能導(dǎo)致毀容、潰瘍、畸形、功能障礙甚至危及生命，故需要積極的醫(yī)療干預(yù)。目前血管瘤的治療方法很多，但是沒有任何一種治療方法對(duì)所有血管瘤有效，而且治療本身也可能發(fā)生一些嚴(yán)重的并發(fā)癥。多年來(lái)尋找到有效、安全治療血管瘤的方法一直是科研工作者和

2、臨床醫(yī)生們孜孜不倦奮斗的目標(biāo)。而之所以有目前治療的窘境就是因?yàn)閷?duì)血管瘤增生和消退的機(jī)制還認(rèn)識(shí)不清。缺乏理想的研究模型是阻礙對(duì)血管瘤病理機(jī)制深入探討的主要原因之一。本科研小組利用人體血管瘤組織塊裸小鼠皮下移植建立人體血管瘤裸小鼠移植模型，來(lái)初步探討嬰幼兒血管瘤發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。 方法：人體血管瘤取自1例2月齡男性患兒左小腿外側(cè)皮膚和皮下血管瘤。將手術(shù)切除的人體血管瘤標(biāo)本的皮下部分，切成5mm×4mm×3mm的小塊，分別經(jīng)裸小鼠的

3、皮膚切口將血管瘤組織塊置于項(xiàng)部、腰背部和雙側(cè)腋下的皮下，每只4處。于移植后第1、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、90、120、180天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最大橫徑a和縱徑b，定期觀察移植瘤體的生長(zhǎng)狀況。分別于移植后56、120、180天各取2個(gè)移植成活瘤體作HE、CD31、Glutl染色。使用Nikon E600研究顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行觀察，用SPOTCool CCD攝像頭進(jìn)行圖像采集。用Image pro plus

4、 4.5版本的專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。測(cè)定在單位視野中免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性顆粒的面積、平均光密度以及積分光密度。采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用X±SD表示，對(duì)免疫反應(yīng)陽(yáng)性顆粒積分光密度進(jìn)行t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。 結(jié)果：血管瘤組織塊移植后3～4周內(nèi)，瘤體基本上無(wú)明顯變化；42天后，大多數(shù)瘤體開始生長(zhǎng)，體積較移植時(shí)增大，瘤體周圍可見新生毛細(xì)血管；56天左右瘤體迅速增大，生長(zhǎng)良好，透過(guò)皮膚見瘤體發(fā)藍(lán)，較

5、有彈性；63天左右達(dá)到最大；之后瘤體體積保持不變或輕微縮小，至90天時(shí)可見部分瘤體顏色變淺，體積縮小，質(zhì)地較前變硬，180天時(shí)少數(shù)瘤體殘留，呈淡黃色，質(zhì)地變硬，剖面呈纖維脂肪組織。 HE染色發(fā)現(xiàn)增生期移植血管瘤內(nèi)大量血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖堆積，聚集成團(tuán)巢狀，血管腔隙小而不規(guī)則；消退期移植血管瘤內(nèi)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞明顯減少，血管腔擴(kuò)大，內(nèi)襯扁平的內(nèi)皮細(xì)胞，大量纖維脂肪組織沉積。 免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示：移植成活的血管瘤CD31呈陽(yáng)性

6、表達(dá)，CD31定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上。移植成活的血管瘤G1utl呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，Glutl定位于血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上。移植供體人血管瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞Glutl染色也呈強(qiáng)陽(yáng)性。 結(jié)論：本研究將人體血管瘤組織塊移植到裸小鼠皮下，成功建立了人體血管瘤裸小鼠移植模型，并且通過(guò)觀察移植瘤的生長(zhǎng)狀況、HE染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)從多方面證實(shí)了該模型能客觀真實(shí)再現(xiàn)人體血管瘤增生和消退的過(guò)程，為后續(xù)試驗(yàn)奠定了良好的動(dòng)物模型基礎(chǔ)。

7、第二部分 血管生成素-1、血管生成素-2及Tie2受體在人體血管瘤裸小鼠移植模型中的表達(dá) 目的：嬰幼兒血管瘤是以血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖和血管異常生成為特點(diǎn)。Mulliken根據(jù)血管瘤組織學(xué)特點(diǎn)將其分為增生期、消退期和消退完成期。血管瘤如何從迅速增生擴(kuò)大轉(zhuǎn)變?yōu)樽园l(fā)緩慢消退，其潛在的分子與生物化學(xué)機(jī)制目前仍認(rèn)識(shí)不清。血管瘤與一般良性腫瘤有著明顯不同之處就是大多數(shù)的嬰幼兒血管瘤可以自行消退，故血管瘤是否為真性腫瘤引起了人們的爭(zhēng)議。近年

8、來(lái)，有眾多研究顯示血管生成素及其Tie2受體家族在正常以及異常血管生成中扮演重要角色，故我們利用已建立的人體血管瘤裸小鼠移植模型來(lái)研究血管生成素-1、血管生成素-2以及Tie2受體在人體血管瘤增生與消退時(shí)期的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況。 方法：動(dòng)物模型建立見第一部分。分別于移植后56天、120天各切取12個(gè)移植存活瘤體。其中2個(gè)瘤體用4％多聚甲醛固定，作免疫組織化學(xué)檢測(cè)(Ang1，Ang2，Tie2和VEGF)；5個(gè)瘤體用Trizol液固定后

9、低溫轉(zhuǎn)運(yùn)作RT-PCR熒光定量檢測(cè)(Angl，Ang2和Tie2)；5個(gè)瘤體低溫轉(zhuǎn)運(yùn)作Western blot檢測(cè)(Ang1，Ang2和Tie2)。另取正常皮膚組織(包莖患兒包皮環(huán)切術(shù)切除的包皮組織)5塊用于熒光定量RT-PCR， Western blot和免疫組織化學(xué)檢測(cè)。使用REST軟件將熒光定量RF-PCR所得Ct值轉(zhuǎn)換為2<'-△△Ct>值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果的圖像采集和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析同第一部分。 結(jié)果：熒

10、光定量RT-PCR和Westem blot的結(jié)果顯示在增生期和消退期移植瘤中，Ang1mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯低于正常包皮組織；Ang2和Tie2mRNA和蛋白的的表達(dá)量明顯高于正常包皮組織。三者的表達(dá)在增生期和消退期移植瘤之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示Ang2和Tie2在增生期和消退期移植瘤中表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，分別定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜上，在正常包皮組織中Ang2和Tie2的表達(dá)呈弱陽(yáng)性。在增生期和消退期移植瘤

11、中，Ang1表達(dá)呈弱陽(yáng)性，定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和血管周圍細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)，在正常包皮組織中Ang1的表達(dá)呈陽(yáng)性。在VEGF免疫組化染色的切片上，發(fā)現(xiàn)在血管瘤組織內(nèi)存在血管發(fā)生(vasculogenesis)這種原始的血管生成方式，這種血管生成方式只有在胚胎時(shí)期和病理狀況下可以出現(xiàn)。 結(jié)論：嬰幼兒血管瘤中存在血管生成素-1、血管生成素-2和Tie2受體的異常表達(dá)，提示嬰幼兒血管瘤可能并非一種真性血管腫瘤，而是一種血管生成異常的