2型糖尿病大鼠心肌脂質(zhì)積聚的原因探索.pdf

1、目的：糖尿病心肌病是糖尿病患者的主要心血管并發(fā)癥之一。脂質(zhì)代謝紊亂是糖尿病心肌病變的一個重要影響因素。 正常心肌從血漿中攝取進入細胞內(nèi)的脂肪酸主要有兩個代謝途徑：一個是在限速酶二?；视王；D(zhuǎn)移酶1(diacylglycerol transferase 1，DGAT1)的催化下酯化生成甘油三酯儲存在細胞內(nèi)部，需要時再由脂肪酶水解，采用的是甘油二酯合成途徑。2型糖尿病狀態(tài)下心肌細胞內(nèi)的脂肪沉積是否與心肌DGAT1的表達變化有關(guān)，未

2、見報道。另一個就是轉(zhuǎn)運到相應(yīng)位點或區(qū)域進行氧化代謝，這些位點包括線粒體和過氧化物酶體等細胞器。脂肪酸在線粒體和過氧化物酶體中經(jīng)β氧化途徑進行氧化，肌型-肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1(muscle-carnifine palmitoyltransferase 1，M-CPT1)、脂酰輔酶A氧化酶(acyl-CoA oxidase,ACOX)分別是兩途徑的限速酶。在心肌細胞過氧化物酶體中，參與脂肪酸氧化的ACOX有ACOX1、ACOX3兩種亞型，AC

3、OX1主要參與直鏈脂肪酸氧化，ACOX3主要參與2-甲基支鏈脂肪酸氧化。過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activatedreceptor α，PPAR α)在心臟脂肪酸氧化的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。2型糖尿病狀態(tài)下這些基因的表達有哪些變化呢? 基于上述目的，本實驗采用高脂飲食誘導(dǎo)出胰島素抵抗再復(fù)加小劑量腹腔注射STZ的方法，成功誘導(dǎo)出2型糖尿病大鼠模型。在此基礎(chǔ)上，觀察心肌細胞中ACOX1、AC

4、OX3、M-CPT1等涉及脂肪酸氧化的基因的表達情況；觀察甘油三酯合成限速酶基因DGAT1，脂肪酸代謝調(diào)節(jié)基因PPAR α的表達情況；同時，測定脂肪酸總的β氧化活性變化，測定心肌組織中甘油三酯及脂肪酸含量的變化。 方法： 1、實驗動物分組及標(biāo)本處理本實驗大鼠共分三組，對照組、單純胰島素抵抗組和糖尿病組。 2、胰島素敏感性測定采用血糖鉗和ISI判定。 3、血中葡萄糖、甘油三酯和胰島素的測定葡萄糖、甘油三酯用

5、氧化酶法測定；胰島素用放射免疫法測定。 4、心肌組織HE染色取部分左心室組織，固定于4％多聚甲醛溶液中，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡觀察心肌細胞形態(tài)學(xué)改變。 5、心肌組織油紅染色心肌組織冰凍切片(厚度8μm)快速放入4％甲醛中固定10 min，取出切片用蒸餾水沖洗干凈，拭干后滴上油紅稀釋染液放入37℃濕盒保溫，每隔3分鐘補加一次染液，重復(fù)4-6次。取出切片用60％異丙醇分化至基質(zhì)清晰(約10 s)，自來水充分沖洗后再投

6、入蘇木精染色液中染核40 s，最后用1％鹽酸分化10 s，水充分沖洗后甘油明膠封片，鏡下觀察。 6 基因mRNA表達的測定用Trizol法提取心肌組織總RNA。以β-ACTIN作為內(nèi)參照，RT-PCR法測定心肌DGAT1、ACOX1、ACOX3、M-CPT1、PPARα mRNA的相對表達量。 7、心肌組織甘油三酯和脂肪酸的測定甘油三酯用氧化酶法測定，脂肪酸用銅顯色法測定。 8、心肌脂肪酸總的β氧化活性測定采用分

7、光光度法，通過軟脂酰CoA氧化引起NAD+的還原來測定脂肪酸β-氧化。每分鐘還原1μ mol NAD+所需的酶量為1個活性單位。樣品的酶活性以每毫克樣品蛋白所含的酶活性單位數(shù)表示(U/mg prot)。 9、心肌組織過氧化氫酶活性測定采用分光光度法，以每分鐘催化1μ mmol H2O2減少所需的酶量作為一個酶活性單位(U)，樣品的酶活性以每mg樣品蛋白所含的酶活性單位數(shù)(U/mg prot)表示。 10 數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)

8、均用-x±s表示，采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理分析，組間比較用單因素方差分析檢驗，檢驗以P＜0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)果： 1、造模 1.1 OGTT試驗高脂組各個時間點血糖值均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 1.2 血中成分及ISI高脂組大鼠體重和空腹血糖高于對照組(P＜0.05)，血中甘油三酯和胰島素的濃度比對照組增高(P＜0.01)。兩組的ISI差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

9、P<0.01)。 1.3 血糖鉗結(jié)果高脂組GIR較對照組減低(P<0.01)，表明高脂組大鼠出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗。 1.4 大鼠的血糖和血胰島素變化STZ腹腔注射后3天，檢測糖尿病組大鼠空腹血糖值均符合2型糖尿病標(biāo)準(zhǔn)，平均值為14.49±3.67mmol/L，對照組為5.25±0.43 mmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。胰島素平均值為19.18±3.47μIU/ml，與對照組18.93±4.41μIU/ml相比差異

10、無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 2、組織病理學(xué)2.1 心肌組織HE染色對照組心肌細胞排列整齊，細胞核大小均一，呈橢圓形，胞漿染色均勻；單純胰島素抵抗組細胞排列尚整齊，未見異常；糖尿病組心肌細胞排列紊亂，胞漿自溶，肌絲斷裂，脂質(zhì)空泡明顯。 2.2 心肌組織油紅染色對照組心肌組織未發(fā)現(xiàn)脂肪滴的存在；單純胰島素抵抗組也未見明顯異常；糖尿病組出現(xiàn)大量彌漫性脂肪小滴。 3、心肌組織各目的基因mRNA的相對表達量的變化3.1

11、 ACOX1 mRNA的相對表達量對照組為0.5498±0.07123，單純胰島素抵抗組為0.6652±0.06484，糖尿病組為0.7417±0.14342。糖尿病組是對照組的1.4倍。 3.2 M-CPT1 mRNA的相對表達量對照組為0.3730±0.09561，單純胰島素抵抗組為0.5288±0.05377，糖尿病組為0.5337±0.04740.糖尿病組是正常對照組的1.4倍。 3.3 DGAT1 mRNA的相對表達量

12、對照組為0.3891±0.06180，單純胰島素抵抗組為0.5494±0.04182，糖尿病組為0.8515±0.0878。糖尿病組是正常對照組的2.2倍。 3.4 PPARα mRNA的相對表達量對照組為0.7065±0.09407，單純胰島素抵抗組為0.8444±0.03091，糖尿病組為0.6635±0.13149。PPARα的表達隨病程的延長先是增加，然后又有回落趨勢。 3.5 ACOX3 mRNA的相對表達量對

13、照組為0.1380±0.03745，單純胰島素抵抗組為0.1811±0.01538，糖尿病組為0.2058±0.01704.糖尿病組是對照組的1.5倍。 4、酶活測定 4.1 心肌組織總的脂肪酸β氧化活性測定(U/mg prot)對照組為0.001712±0.000334，單純胰島素抵抗組為0.002492±0.000796，糖尿病組為0.003016±0.000714。糖尿病組是對照組的1.8倍。 4.2 心肌

14、組織過氧化氫酶活性測定(U/mg prot)對照組為32.11361±2.715636，單純胰島素抵抗組為10.64068±2.483603，糖尿病組為11.83867±2.54193。隨著病情發(fā)展，心肌組織過氧化氫酶活性是逐漸下降的。 5、心肌組織甘油三酯含量測定(nmol/mg組織)對照組為3.7474±1.6784，單純胰島素抵抗組為8.3811±3.4601，糖尿病組為18.1837±11.1713。隨著病情發(fā)展，心肌組

15、織甘油三酯含量增加，脂質(zhì)積聚明顯，糖尿病組是對照組的4.9倍。 6、心肌組織總脂肪酸含量測定(μmol/g prot)對照組為158.0271±54.68046，單純胰島素抵抗組為186.5958±56.95322，糖尿病組為124.8384±56.07559。隨著病情發(fā)展，心肌組織總脂肪酸含量未見變化。 結(jié)論： 1、2型糖尿病時，心肌脂肪酸氧化的增強不僅與線粒體脂肪酸氧化增強有關(guān)，還與ACOX1、ACOX3表達