SREBPs在糖尿病大鼠腎臟脂質(zhì)沉積中的作用.pdf

1、目的：糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的一種慢性并發(fā)癥，嚴(yán)重危害人類的健康。本研究應(yīng)用大鼠糖尿病模型和體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞，從整體、細(xì)胞和分子等不同水平，系統(tǒng)觀察了糖尿病腎臟中SREBPs蛋白表達(dá)情況及其靶基因調(diào)控；并構(gòu)建并鑒定了抑制人SREBP-1基因的shRNA真核表達(dá)載體。 方法 1.SREBP-1和SREBP-2在糖尿病大鼠腎臟的表達(dá)和意義 將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為正常對

2、照組(N組，25只)、糖尿病組(DM組，25只)和胰島素處理組(INS組，10只)。糖尿病模型采用腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，溶于0.1mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，pH值4.5，60mg/kg)，對照組只注射相當(dāng)體積的枸櫞酸鹽緩沖液，48h后尾尖取血，血糖=16.7mmol/L者確定為I型DM模型。分別于注射STZ后1、2、4、8周每組取6只大鼠，稱重后腹腔注射10％水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，離心分離血清

3、，用于測定血糖、血甘油三酯和膽固醇；取部分腎組織置于4％多聚甲醛固定，用于免疫組化檢測；部分腎皮質(zhì)組織經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱，用于冰凍切片制作和提取蛋白及RNA。應(yīng)用免疫組化、Western blot以及RT-PCR觀察糖尿病大鼠腎臟SREBP-1、SREBP-2蛋白及mRNA表達(dá)的影響。 2.SREBP-1重組質(zhì)粒在人腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和影響 采用CaCl2法制備DH5a感受態(tài)，將惠贈的SREBP-1重組質(zhì)

4、粒溶解并轉(zhuǎn)化感受態(tài)，搖菌擴(kuò)增后酶切鑒定并大量提取。人腎小管上皮細(xì)胞(HKC細(xì)胞)用含10％胎牛血清及100KU/L青霉素、100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2。經(jīng)同步化后將細(xì)胞隨機(jī)分為3組，空白細(xì)胞對照組、pcDNA3.1空質(zhì)粒對照組和pcDNA3.1-SC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染采用陽離子脂質(zhì)體法，48小時后終止培養(yǎng)進(jìn)行油紅O染色和蛋白、RNA提取。采用Western blot檢測SREBP-1蛋白表達(dá)；半

5、定量RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)SREBP-1 mRNA、FAS mRNA的表達(dá)。 3.高糖對人腎小管上皮細(xì)胞SREBP-1表達(dá)和脂滴形成的影響 人腎小管上皮細(xì)胞用含10％胎牛血清及100KU/L，青霉素、100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分成2組，分別為：高糖組(30mmol/L，High glucose，HG)；正常糖組(5.5mmol/L，normal glucose，NG)。于刺激后12、24、48和

6、72小時收集細(xì)胞，提取總蛋白，Westernblot檢測SREBP-1蛋白的表達(dá)：同時提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行SREBP-1mRNA檢測；細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況采用油紅O方法檢測。 4.針對SREBP-1基因的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 設(shè)計和構(gòu)建能表達(dá)針對SREBP-1基因的siRNA的RNA干擾載體和表達(dá)不針對任何已知人類基因的siRNA的RNA干擾陰性對照載體，分別通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至HKC細(xì)胞。HKC細(xì)胞用含10

7、％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，24h后待細(xì)胞長至70-80％左右開始轉(zhuǎn)染，共分3組：①實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)染pGenesil-1-SREBP1-1和pGenesil-1-SREBP1-2；②空白對照組：未轉(zhuǎn)染組；③陰性對照組：轉(zhuǎn)染pGenesil-HK。轉(zhuǎn)染步驟按Lipofectamine2000說明書進(jìn)行，48小時后進(jìn)行蛋白和RNA的提取，采用Western blot檢測SRE

8、BP-1的表達(dá)；半定量RT-PCR檢測細(xì)胞SREBP-1 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果: 1.SREBP-1和SREBP-2在糖尿病大鼠腎臟的表達(dá)和意義 同正常組大鼠相比，糖尿病大鼠。腎臟膽固醇含量沒有明顯變化，而甘油三酯含量在1、2、4、8周均出現(xiàn)了明顯升高。冰凍切片油紅O染色可見糖尿病大鼠腎臟近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯脂滴，呈紅染顆粒狀，而腎小球內(nèi)未見有脂滴染色。免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，SREBP-1在正常大鼠和糖尿病大鼠腎

9、臟定位于近曲小管上皮細(xì)胞胞漿，胞核無著色，腎小球內(nèi)未見有棕黃色顆粒。經(jīng)圖像分析顯示：SREBP-1在糖尿病大鼠腎臟表達(dá)在4個時間點(diǎn)均明顯高于正常大鼠，其中2周時SREBP-1表達(dá)量最高，IPP軟件分析陽性區(qū)域積分光密度值(IOD)為80019.17±5698.51，是正常大鼠的2.43倍。SREBP-1蛋白有兩種形式：前體和成熟片段(活性形式)，本研究采用Western blot進(jìn)一步檢測了這兩種形式的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎組織在四

10、個時間點(diǎn)均呈高表達(dá)，2周表達(dá)量最高，前體為0.673±0.027，成熟片段為0.670±0.028。SREBP-1 mRNA的檢測應(yīng)用原位雜交技術(shù)，結(jié)果證實(shí)正常對照組大鼠腎臟內(nèi)未見明顯表達(dá)，糖尿病模型鼠腎皮質(zhì)內(nèi)有明顯棕黃色顆粒出現(xiàn)，定位于腎小管上皮細(xì)胞胞漿，腎小球內(nèi)未見著色。注射胰島素處理2周后，蛋白印跡檢測結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)相對于正常大鼠，模型鼠腎臟SREBP-1前體表達(dá)下降了52.8％，相似地，成熟片段表達(dá)量下降了30.9％。原位雜交結(jié)果

11、證實(shí)胰島素處理避免了糖尿病大鼠SREBP-1 mRNA的上調(diào)。相應(yīng)地腎臟甘油三酯含量檢測也發(fā)現(xiàn)胰島素處理引起甘油三酯含量的相應(yīng)下降。 免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)在正常大鼠和糖尿病大鼠腎臟SREBP-2均未有明顯表達(dá)，僅部分區(qū)域有較淡著色。進(jìn)一步采用Western blot證實(shí)前體和成熟片段在對照組和糖尿病組間表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。 2.SREBP-1重組質(zhì)粒在人腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和影響 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人腎小管上皮細(xì)胞48

12、小時后，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)SREBP-1 mRNA表達(dá)的檢測，pcDNA3.1-SC1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)SREBP-1 mRNA表達(dá)呈現(xiàn)明顯升高，擴(kuò)增條帶積分光密度值為1.237833±0.095468，分別是空白對照組和陰性對照組的6.158倍和4.194倍。SREBP-1蛋白的表達(dá)檢測采用Western blot方法，結(jié)果顯示：pcDNA3.1-SC1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48小時后SREBP-1蛋白出現(xiàn)明顯上調(diào)，在68kD位

13、置上出現(xiàn)深染條帶，經(jīng)LabWorks軟件分析條帶積分光密度值為3.091833±0.253996；相反地，對照組均未見SREBP-1的高表達(dá)。采用油紅O染色方法檢測細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況。空白對照組和pcDNA3.1陰性對照組細(xì)胞內(nèi)均未見有紅染脂滴顆粒，而pcDNA3.1-SC1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中出現(xiàn)了清晰的紅染顆粒。FAS mRNA表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)在’pcDNA3.1-SC1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中，F(xiàn)AS mRNA出現(xiàn)明顯升高，表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照

14、組。 3.高糖對人腎小管上皮細(xì)胞SREBP-1表達(dá)和脂滴形成的影響 正常糖組腎小管上皮細(xì)胞未見脂滴形成，高糖刺激12、24小時同樣未見有脂滴，48、72小時組細(xì)胞內(nèi)可見較多的、明顯的脂滴，染成紅色、顆粒狀。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，SREBP-1表達(dá)于胞漿，高糖刺激后，腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)SREBP-1的表達(dá)高于正常糖組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)其中48小時組，正常糖組IOD值為6522555.167，高糖組為179467

15、42.17，差異最為顯著。Western Blot檢測SREBP-1蛋白前體片段和成熟片段表達(dá)，結(jié)果顯示12、24、48、72小時高糖組SREBP-1前體(125kD)和成熟體(68kD)表達(dá)量均高于正常糖組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；同時發(fā)現(xiàn)，高糖刺激下SREBP-1前體和成熟體表達(dá)隨時間延長逐漸增多，到48小時達(dá)到高峰，72小時有所回落。半定量RT-PCR分析顯示：和蛋白水平結(jié)果相似，高糖明顯上調(diào)了SREBP-1 mRNA的表達(dá)，在4個時間

16、點(diǎn)，高糖組表達(dá)量均明顯高于正常糖對照組。 4.針對SREBP-1基因的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 結(jié)論：①Ⅰ型糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞SREBP-1蛋白表達(dá)明顯升高，SREBP-1 mRNA水平亦明顯上調(diào)，腎臟甘油三酯含量顯著增多，給與胰島素處理后均呈現(xiàn)明顯下降。高糖-SREBP-1-甘油三酯途徑可能參與了糖尿病腎病脂質(zhì)沉積的發(fā)生和發(fā)展。②人重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SC1能夠激活體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞SREB