樹(shù)突狀細(xì)胞輻射損傷及免疫系統(tǒng)輻射防護(hù)研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著核輻射在工業(yè)、醫(yī)療、軍事等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，人們?cè)谙硎茈婋x輻射、核能帶來(lái)的諸多便利的同時(shí)，也增加了受照的風(fēng)險(xiǎn)，輻射安全越來(lái)越受到學(xué)界及公眾的關(guān)注。免疫系統(tǒng)對(duì)輻射非常敏感，電離輻射照射早期，免疫器官結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，免疫細(xì)胞大量凋亡，即使照后很長(zhǎng)一段時(shí)間，免疫功能仍然維持低下。研究輻射對(duì)免疫系統(tǒng)的損傷效應(yīng)及其分子機(jī)制，開(kāi)發(fā)安全有效的防治策略，對(duì)保護(hù)電離輻射對(duì)免疫系統(tǒng)的損傷意義重大。
　　以往的輻射免疫學(xué)研究主要集

2、中在輻射敏感的T、B淋巴細(xì)胞等方面，對(duì)發(fā)現(xiàn)較晚的樹(shù)突狀細(xì)胞（DendriticCells，DC）研究較少，這方面尚屬空白。隨著對(duì)DC功能作用的研究深入，發(fā)現(xiàn)它們是最重要的抗原提呈細(xì)胞，是連接固有免疫和獲得性免疫的橋梁，在抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)中具有十分重要的作用。DC多以未成熟的狀態(tài)存在，平時(shí)定居在外周組織，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，DC經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)感染部位，攝取抗原并遷移至位于二級(jí)淋巴器官的T細(xì)胞區(qū)，啟動(dòng)獲得性免疫。而DC迅速、準(zhǔn)確的遷移

3、到T細(xì)胞區(qū)是其發(fā)揮抗原呈遞功能、激活獲得性免疫的前提。此外，DC具有多種亞型，分別分布在機(jī)體的不同部位，發(fā)揮各自的免疫學(xué)功能。利用細(xì)胞活力分析、細(xì)胞凋亡等觀(guān)察手段發(fā)現(xiàn)，DC與其淋巴細(xì)胞相比具有較強(qiáng)的輻射抗性。但是，受照后活存的DC細(xì)胞功能有無(wú)損傷、亞型有無(wú)變化，在照后機(jī)體免疫功能恢復(fù)中起到什么作用未見(jiàn)深入研究。本研究中，我們探索輻射對(duì)DC遷移功能及其亞型的影響，以及它們?cè)诜派鋼p傷中的作用，這對(duì)揭示輻射對(duì)免疫系統(tǒng)的影響的具體機(jī)制，開(kāi)發(fā)新型

4、的輻射防治手段具有重要意義。
　　另一方面，免疫系統(tǒng)輻射損傷的防護(hù)一直是輻射防護(hù)領(lǐng)域重要難題之一。其主要原因一是細(xì)胞輻射敏感性分子機(jī)制尚未徹底闡明，難以找到防護(hù)研究所需的特異性分子靶點(diǎn)，二是多年研究未解決高效、無(wú)毒副作用醫(yī)學(xué)防護(hù)措施的難題。所以，有必要從揭示細(xì)胞輻射敏感性分子機(jī)制和尋找高效、無(wú)毒副作用化合物等多角度開(kāi)展研究。研究細(xì)胞輻射敏感性的分子機(jī)制，對(duì)理解不同免疫細(xì)胞之間的輻射抗性的區(qū)別，篩選輻射抗性相關(guān)基因，開(kāi)發(fā)特異性輻射防

5、治手段具有重要意義。本研究中我們篩選了輻射誘導(dǎo)WRN磷酸化的位點(diǎn)S1141，并對(duì)其功能及其在輻射損傷中作用進(jìn)行了研究，初步探討了WRN蛋白S1141位點(diǎn)磷酸化在細(xì)胞輻射敏感性中的作用機(jī)制。在免疫系統(tǒng)輻射損傷防護(hù)研究方面，本項(xiàng)目傳承了我們教研室分子氫輻射防護(hù)作用的研究思路，在分子氫對(duì)整體動(dòng)物的輻射防護(hù)作用，對(duì)造血系統(tǒng)、雄性生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等均具有很好的輻射防護(hù)作用的研究基礎(chǔ)上，探討分子氫對(duì)免疫系統(tǒng)的輻射防護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)分子氫不僅對(duì)γ射線(xiàn)照

6、射導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)的損傷具有很好的防護(hù)效果，對(duì)空間重離子12C6+照射導(dǎo)致的免疫細(xì)胞損傷，也起到很好的保護(hù)作用。
　　研究?jī)?nèi)容：
　　一、全身照射后DC遷移功能的變化
　　1.全身照射對(duì)表皮及真皮DC密度和DC遷移功能的影響；
　　2.全身照射對(duì)皮膚組織中遷移相關(guān)的趨化因子和炎癥因子表達(dá)水平的影響；
　　3.NF-kB在輻射誘導(dǎo)皮膚DC遷移中的分子機(jī)理探討。
　　二、全身照射后DC亞型的變化及其在放射病

7、中的作用
　　1.全身照射后小鼠DC亞型的比例和分布的變化。
　　2.腫瘤放療患者外周血中各亞型DC比例的變化。
　　3.全身照射對(duì)CD8+DC和CD8-DC的失衡的機(jī)理探討；
　　4.CD8+DC和CD8-DC失衡在輻射導(dǎo)致的Th1/Th2平衡中的作用。
　　三、分子氫對(duì)免疫系統(tǒng)輻射損傷的防護(hù)作用
　　1.分子氫對(duì)γ射線(xiàn)全身照射后免疫細(xì)胞的防護(hù)作用；
　　2.分子氫對(duì)γ射線(xiàn)照后血象的保護(hù)作用；

8、
　　3.分子氫對(duì)重離子輻射導(dǎo)致的免疫細(xì)胞損傷的防護(hù)作用；
　　4.分子氫對(duì)輻射誘導(dǎo)的羥自由基和ROS的清除作用；
　　5.分子氫對(duì)照后凋亡分子caspase3的影響。
　　四、WRN蛋白S1141位點(diǎn)磷酸化在細(xì)胞輻射損傷中的作用
　　1.輻射導(dǎo)致的WRN蛋白的磷酸化位點(diǎn)S1141的鑒定；
　　2.WRN蛋白S1141位點(diǎn)磷酸化對(duì)細(xì)胞輻射損傷效應(yīng)的影響；
　　3.WRN蛋白S1141位點(diǎn)磷酸化在

9、基因組穩(wěn)定性維持中的作用；
　　4.WRN蛋白S1141位點(diǎn)磷酸化在照后DNA損傷反應(yīng)中的作用；
　　5.ATM在輻射誘導(dǎo)WRN蛋白S1141位點(diǎn)磷酸化中的作用。
　　研究方法：
　　1.γ射線(xiàn)和重離子照射
　　DC輻射損傷部分和分子氫防護(hù)γ射線(xiàn)損傷部分均使用我校輻照中心Co-60輻照源進(jìn)行照射;重離子輻射防護(hù)部分使用中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所重離子大型輻照裝置進(jìn)行照射;WRN蛋白磷酸化部分在美國(guó)德克薩斯大學(xué)

10、西南醫(yī)學(xué)中心用Cs-137輻射源進(jìn)行照射。
　　2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞
　　DC部分實(shí)驗(yàn)使用C57BL/6小鼠;分子氫防護(hù)免疫系統(tǒng)損傷部分使用Balb/c小鼠，使用人淋巴母細(xì)胞AHH-1細(xì)胞;WRN實(shí)驗(yàn)部分使用SV-40永生化的WS患者來(lái)源的細(xì)胞。
　　3.FITC過(guò)敏反應(yīng)誘導(dǎo)的皮膚DC的遷移
　　根據(jù)文獻(xiàn)方法，使用含有FITC的丙酮和二丁酯誘導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)模型，促進(jìn)皮膚DC向淋巴結(jié)的遷移，在淋巴結(jié)收集CD11c+的D

11、C，若同時(shí)具有FITC著色，則表明是由皮膚遷移過(guò)來(lái)的。
　　4.皮膚表皮分離與真皮切片
　　將鼠耳摘除，分離其背側(cè)面和腹側(cè)面，將腹側(cè)面放在EDTA溶液中孵育，破壞表皮與真皮之間的連接。然后用注射器針頭輕輕剝離，得到表皮用于免疫熒光染色。皮膚組織用OCT包埋后，進(jìn)行冰凍切片。
　　5.免疫熒光染色
　　將鼠耳或做好的冰凍切片，用多聚甲醛固定，然后通過(guò)封閉，抗體孵育等步驟，進(jìn)行染色，最后用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色并封片

12、，鏡下觀(guān)察，拍照。
　　6.流式細(xì)胞儀分析
　　對(duì)于各亞型的DC，用帶有不同熒光素的抗體標(biāo)記，然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，最后用分析軟件，分析各群細(xì)胞的比例。
　　7.CCL19誘導(dǎo)的組織DC的遷移
　　摘除鼠耳，將其背側(cè)面與腹側(cè)面分離，然后將背側(cè)面放在培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時(shí)，以去除非遷移的細(xì)胞，然后放在含有趨化因子CCL19的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集遷移的細(xì)胞，用流式計(jì)數(shù)。
　　8.實(shí)時(shí)熒光定量PCR
　　取皮膚或

13、淋巴結(jié)組織，提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，然后用RealtimePCR反應(yīng)，得到各組反應(yīng)的CT值，計(jì)算每個(gè)基因表達(dá)倍數(shù)的變化。
　　9.蛋白樣品制備
　　使用含有蛋白酶和蛋白激酶的抑制劑的RIPA裂解液，勻漿裂解組織，或裂解細(xì)胞，得到細(xì)胞或組織總蛋白;核蛋白提取:使用核蛋白提取試劑盒提取組織核蛋白。
　　10.Westernblotting檢測(cè)蛋白表達(dá)情況
　　提取蛋白后，使用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)量各組蛋白的

14、濃度，然后根據(jù)蛋白濃度上樣，進(jìn)行SDS電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體孵育，顯影等，檢測(cè)蛋白表達(dá)水平的變化。
　　11.小鼠BMDC誘導(dǎo)培養(yǎng)
　　無(wú)菌取股骨，用無(wú)菌培養(yǎng)基沖出骨髓細(xì)胞，用Tris-NH4Cl破紅后，在含有GM-CSF和IL-4的RMPI1640培養(yǎng)基中刺激培養(yǎng)48小時(shí)，輕輕吹打吸去懸浮細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)至第5天，收集懸浮細(xì)胞，換為正常的RMPI1640培養(yǎng)基即為BMDC。
　　12.富氫溶液培養(yǎng)基制備
　　將高

15、純度氫氣充入裝有培養(yǎng)基或生理鹽水的袋中，使用高氣壓設(shè)備，在0.4MPa的氣壓下放置4小時(shí)，然后緩慢減壓，待將為常壓時(shí)取出，保存以備使用。
　　13.羥自由基檢測(cè)
　　在照射前向培養(yǎng)基中加入HPF羥自由基探針，孵育AHH-1細(xì)胞，照后立即離心收集細(xì)胞，取載玻片制作細(xì)胞涂片，用熒光顯微鏡拍照，分析熒光強(qiáng)度，計(jì)算羥自由基水平。
　　14.小鼠血常規(guī)檢測(cè)
　　使用小動(dòng)物血常規(guī)檢測(cè)分析儀檢測(cè)小鼠血象變化。
　　15.

16、caspase3活性檢測(cè)
　　使用小鼠Caspase3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)小鼠脾臟勻漿液中caspase3活性的變化，通過(guò)檢測(cè)各孔的A405吸光值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算caspase3的活性。
　　16.活性氧水平檢測(cè)
　　本研究使用活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)照后AHH-1細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，用DCFH-DA探針?lè)跤?xì)胞一段時(shí)間后照射，用流式細(xì)胞儀分析平均熒光強(qiáng)度，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)活性氧相對(duì)水平的變化。
　　17.細(xì)胞凋亡檢測(cè)

17、r>　　使用AnnexinⅤ細(xì)胞凋亡試劑盒用流式細(xì)胞儀分析照后免疫細(xì)胞的凋亡;使用TUNEL染色法標(biāo)記細(xì)胞原位凋亡情況。另外，用Hoechst染色法，計(jì)算凋亡率。
　　18.WRN突變型細(xì)胞系構(gòu)建
　　在永生化WS細(xì)胞的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-WRN和1141A突變-WRN，1141D突變WRN，建立穩(wěn)篩細(xì)胞系，得到WT，1141A和1141D細(xì)胞。
　　19.克隆形成率實(shí)驗(yàn)
　　將各組細(xì)胞按照不同數(shù)目種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中

18、，給予不同劑量照射，將細(xì)胞培養(yǎng)7-14天，注意觀(guān)察克隆生長(zhǎng)情況，最后用含有甲醇的吉姆薩染液染色，統(tǒng)計(jì)克隆形成情況，計(jì)算克隆形成率。
　　20.細(xì)胞周期分析
　　收集細(xì)胞，PBS清洗后，用冰乙醇固定，然后用Rnase處理去除RNA，用PI對(duì)DNA進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期;對(duì)于M期細(xì)胞周期分析，參照免疫熒光染色方法，用pH3抗體染色，再結(jié)合PI染色方法，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化。
　　21.免疫共沉淀(IP)<

19、br>　　提取細(xì)胞總蛋白后，加入Flag抗體和ProteinA的珠子，孵育過(guò)夜，然后離心珠子，并清洗，獲得Flag特異性結(jié)合的蛋白。進(jìn)行SDS電泳實(shí)驗(yàn)。
　　研究結(jié)果：
　　一、全身照射后DC遷移功能的變化
　　1.全身照射導(dǎo)致表皮及真皮DC數(shù)目減少，促進(jìn)DC遷移發(fā)現(xiàn)亞致死劑量(6Gy)全身照射后，表皮樹(shù)突狀細(xì)胞密度明顯降低，于第三天達(dá)到最低，之后有所恢復(fù);發(fā)現(xiàn)照后腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)DC比例明顯增高。我們研究了真皮中DC的

20、數(shù)目變化，發(fā)現(xiàn)2Gy照射后變化不明顯，但4Gy、6Gy照射后，真皮DC數(shù)目明顯減少，說(shuō)明輻射促進(jìn)了皮膚DC的遷移。2Gy，4Gy照射后，將鼠耳分離，在含CCL19的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，48小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中DC的數(shù)目明顯增多，說(shuō)明輻射促進(jìn)了鼠耳DC向CCL19的遷移。
　　2.輻射對(duì)小鼠皮膚組織CCR7和CCR19的mRNA表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)6Gy照后2小時(shí)、4小時(shí)，皮膚組織中CCR7的mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)，8小時(shí)接近正常水平。且照后2

21、-8小時(shí)皮膚和淋巴結(jié)中的CCL19和CCL21的表達(dá)都呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，同時(shí)，輻射導(dǎo)致的CCL19，CCL21的表達(dá)也具有明顯的劑量依賴(lài)性。
　　3.全身照射后皮膚炎性因子表達(dá)的變化發(fā)現(xiàn)6Gy照射明顯上調(diào)皮膚中TNF-α，IL-1α，IL-Iβ，IL-6的表達(dá)，這些細(xì)胞因子均可能參與DC的激活;輻射導(dǎo)致細(xì)胞因子的表達(dá)在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)的趨勢(shì)。
　　4.全身照射通過(guò)激活NF-kB促進(jìn)皮膚DC的遷移發(fā)現(xiàn)輻射對(duì)總NF-kBp65

22、沒(méi)有明顯影響，但可以明顯誘導(dǎo)p65的核轉(zhuǎn)位，增加其在細(xì)胞核中的表達(dá)水平，說(shuō)明輻射激活了NF-kB信號(hào)分子。而NF-kB的抑制劑PDTC（100mg/ml）處理組，DC密度幾乎接近單純對(duì)照水平。
　　二、全身照射后DC亞型的變化及其在放射病中的作用
　　1.全身照射導(dǎo)致小鼠脾臟DC亞型的變化γ射線(xiàn)全身照射之后，C57BL/6小鼠CD11c+MHC2+DC比例明顯增加，于第三天達(dá)到峰值，照后一個(gè)月，基本恢復(fù)到正常水平;照后CD8

23、+DC比例明顯下降，CD8+DC與CD8-DC的比值大幅下降呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，于照后第三天達(dá)到最低。
　　2.輻射不導(dǎo)致CD8+DC和CD8-DC的調(diào)亡和分布
　　通過(guò)在體照射、離體照射和原位凋亡等方法檢測(cè)，均發(fā)現(xiàn)輻射對(duì)CD8+DC和CD8-DC的細(xì)胞凋亡沒(méi)有明顯影響。全身照射后血液、淋巴結(jié)中也發(fā)現(xiàn)CD8+DC和CD8-DC的
　　3.全身照射對(duì)DC分化的影響
　　照后小鼠骨髓細(xì)胞分化成CD11c+DC的能力變強(qiáng)，

24、而分化成CD8+DC的比例明顯減少。我們還檢測(cè)了CD8+DC和CD8-DC分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子IRF8，IRF4，BATF3以及CD8+DC分化相關(guān)細(xì)胞因子FLT3，發(fā)現(xiàn)照后IRF4和IRF8表達(dá)均下調(diào)。
　　4.全身照射導(dǎo)致Th1免疫反應(yīng)減弱而Th2反應(yīng)增強(qiáng)發(fā)現(xiàn)脾臟切片IFN-γ陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯減少，而IL-4陽(yáng)性細(xì)胞的比例增加，說(shuō)明照后發(fā)生了Th1向Th2的偏移。通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Tbet和Gata3的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)照后Tbet表

25、達(dá)下降，而Gata3表達(dá)增加，提示Th1和Th2反應(yīng)的變化。由于IL-12在Th1反應(yīng)中具有重要作用，且其主要來(lái)源是CD8+DC，我們發(fā)現(xiàn)照射后脾臟組織IL-12的mRNA表達(dá)水平明顯下降，與DC亞型變化趨勢(shì)一致。
　　5.FLT3配體減輕輻射導(dǎo)致的CD8+DC和CD8-DC失衡和Th1/Th2的失衡FLT3配體減少了照后CD11c+MHC2+DC的比例，F(xiàn)LT3處理后，CD8+DC和CD8-DC的比例失衡得到改善，Tbet和Ga

26、ta3的比例也有所增加。
　　6.腫瘤放療患者外周血中各型DC亞型比例的變化我們發(fā)現(xiàn)和未放療的患者相比，外周血中總HLA-DR+Lin-DC的比例增高，這與我們小鼠的研究相似。另外我們發(fā)現(xiàn)照后與小鼠CD8+DC同源的人BDCA3+DC有所下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　三、分子氫對(duì)γ射線(xiàn)和重離子照射導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)輻射損傷的防護(hù)作用
　　1.分子氫減輕γ射線(xiàn)和12C6+重離子照射后免疫細(xì)胞的凋亡水平照前腹腔注射富氫鹽水，可以

27、有效減少γ射線(xiàn)導(dǎo)致的胸腺和脾臟細(xì)胞的凋亡。分子氫顯著提高照后外周血白細(xì)胞的數(shù)目，而對(duì)其余血常規(guī)指標(biāo)沒(méi)有明顯影響。重離子輻照明顯導(dǎo)致AHH-1細(xì)胞的凋亡，氫水組凋亡明顯降低。
　　2.分子氫減輕12C6+重離子輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯
　　12C6+重離子(1，2Gy)照射可以導(dǎo)致明顯的G2/M細(xì)胞周期阻滯，富氫鹽水處理組，G2/M阻滯情況得以改善。
　　3.分子氫降低γ射線(xiàn)和重離子輻射誘導(dǎo)的羥自由基和ROS水平
　

28、　使用HPF熒光探針檢測(cè)了分子氫對(duì)γ射線(xiàn)(8Gy)照后AHH-1細(xì)胞中的羥自由基水平的影響，發(fā)現(xiàn)和正常培養(yǎng)基相比，富氫培養(yǎng)基孵育可以明顯減少照后細(xì)胞內(nèi)羥自由基的水平;分子氫處理有效減少了重離子照射細(xì)胞里羥自由基的水平，降低了總ROS活性，我們還發(fā)現(xiàn)，和普通生理鹽水相比，氫水中羥自由基的含量明顯降低。
　　4.分子氫抑制γ射線(xiàn)和重離子輻射激活caspase3
　　ELISA結(jié)果顯示，γ射線(xiàn)照射后，caspase3活性明顯增加，

29、加氫組明顯降低。重離子輻射導(dǎo)致c-caspase3的激活，在觀(guān)察范圍內(nèi)具有劑量依賴(lài)性，而相比于相同劑量照射組，在照射+H2組c-caspase3的表達(dá)明顯降低。
　　四、WRN蛋白S1141位點(diǎn)磷酸化在細(xì)胞輻射損傷中的作用
　　1.照后WRN蛋白的磷酸化位點(diǎn)鑒定
　　收集照射和未照射的Hela細(xì)胞，提取并純化WRN蛋白。將純化的WRN蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，比較兩組的差異，得到WRN的磷酸化位點(diǎn)“S1141”。
　　2

30、.輻照后WRN蛋白磷酸化變化情況
　　發(fā)現(xiàn)不同劑量輻射明顯誘導(dǎo)WRN蛋白S1141位點(diǎn)磷酸化，具有明顯的劑量依賴(lài)性。又研究了照后不同時(shí)間S1141磷酸化的影響，發(fā)現(xiàn)照后30分鐘達(dá)到最強(qiáng)，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了10Gy照射后30分鐘作為輻射導(dǎo)致WRN蛋白磷酸化的檢測(cè)觀(guān)察點(diǎn)。
　　3.輻射導(dǎo)致的S1141位點(diǎn)磷酸化是ATM依賴(lài)的
　　發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞10Gy照射后30分鐘，S1141位點(diǎn)已發(fā)生磷酸化，而在3μM，10

31、μMATM抑制劑(KU55933)處理組，WRN磷酸化明顯減弱，且10μM抑制效果更明顯。DNA-PKcs抑制劑可抑制DNA-PKcsS2056位點(diǎn)的磷酸化，但對(duì)WRN蛋白磷酸化沒(méi)有影響。這一現(xiàn)象在ATM-/-和DNA-PKcs-/-細(xì)胞中得到證實(shí)。
　　4.WRN蛋白S1141位點(diǎn)突變細(xì)胞系的建立
　　我們?cè)赪S患者永生化細(xì)胞（WS細(xì)胞）的基礎(chǔ)上構(gòu)建了WS+野生型WRN(WT細(xì)胞)，WS+1141丙氨酸(A)突變型WRN（

32、1141A細(xì)胞），WS+1141天冬氨酸(D)突變型（1141D細(xì)胞），經(jīng)Westernblot檢測(cè)，細(xì)胞系構(gòu)建成功。
　　5.WRN蛋白S1141位點(diǎn)突變對(duì)輻射敏感型的影響
　　發(fā)現(xiàn)相比于WT細(xì)胞，WS細(xì)胞和1141A細(xì)胞輻射敏感性有所增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而1141D細(xì)胞的輻射敏感性明顯降低。
　　6.WRN蛋白S1141位點(diǎn)磷酸化在輻射導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯中的作用
　　在WS和WRN蛋白S1141位點(diǎn)A突變型細(xì)胞

33、中，照后G2/M阻滯更明顯，照后4小時(shí)已很明顯，12小時(shí)達(dá)到峰值，但16小時(shí)甚至24小時(shí)后，細(xì)胞周期阻滯仍難以恢復(fù);然后我們檢測(cè)了pH3陽(yáng)性細(xì)胞的變化，發(fā)現(xiàn)在WS和1141A突變型細(xì)胞中，照后M期細(xì)胞迅速減少，恢復(fù)明顯減慢。
　　7.照后DNA損傷反應(yīng)通路蛋白的變化
　　我們檢測(cè)了G2細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵通路:ATM-Chk2通路和p53-p21-cdc2通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和磷酸化水平的變化，發(fā)現(xiàn)在三種細(xì)胞中輻射可誘導(dǎo)ATM及

34、其下游分子磷酸化，無(wú)明顯區(qū)別;但我們發(fā)現(xiàn)在WS和1141A細(xì)胞中，輻射可以明顯誘導(dǎo)p53的激活。
　　8.WRN蛋白S1141位點(diǎn)磷酸化在基因組穩(wěn)定性維持中的作用
　　在WS和WRN的S1141A突變型細(xì)胞里，輻射導(dǎo)致明顯的染色體畸變，畸變率高于WT細(xì)胞，但在A突變型細(xì)胞內(nèi)低于WS細(xì)胞。
　　分析討論：
　　免疫系統(tǒng)的輻射敏感性較高，中等劑量的電離輻射即可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷，且恢復(fù)困難。本研究探討了電離輻射照

35、射后DC表型及功能的變化及初步的機(jī)制;探討了分子氫對(duì)γ射線(xiàn)和重離子輻射導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)損傷的防護(hù)效應(yīng);最后以WRN蛋白磷酸化在細(xì)胞輻射敏感性中的作用研究為切入點(diǎn)，探討了輻射導(dǎo)致的細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。
　　DC是最重要的抗原提呈細(xì)胞，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮核心調(diào)節(jié)作用，而關(guān)于輻射對(duì)DC影響的研究較少。之前有研究報(bào)道局部照射促進(jìn)DC遷移，而我們的研究顯示照射體外培養(yǎng)的DC可以抑制DC的遷移，本研究我們明確了全身照射可以促進(jìn)外周DC向淋巴結(jié)的遷

36、移，并從炎癥因子、趨化因子和NF-kB信號(hào)通路激活的角度，揭示了全身照射對(duì)皮膚DC遷移功能的影響的初步機(jī)制，闡釋了NF-kB在這一過(guò)程中的關(guān)鍵作用。另外，本研究首次探討了輻射對(duì)DC亞型的影響，發(fā)現(xiàn)輻射可以導(dǎo)致CD8+和CD8-DC的失衡，并且導(dǎo)致Th1和Th2免疫反應(yīng)的失衡。由于CD8+DC主要誘導(dǎo)Th1免疫反應(yīng)，CD8-DC主要誘導(dǎo)Th2反應(yīng)，隨后我們一方面，從遷移和再分布、凋亡、分化等角度探討了輻射導(dǎo)致CD8+DC和CD8-DC失衡

37、的機(jī)制;另一方面，我們探討了這CD8+DC和CD8-DC比例下降對(duì)于Th1/Th2免疫平衡的影響。初步尋找了IL-12可能是介導(dǎo)CD8+DC和Th1反應(yīng)之間的重要因子。發(fā)現(xiàn)FLT3配體對(duì)調(diào)控這兩型DC的恢復(fù)方面有重要作用，同時(shí)，我們的發(fā)現(xiàn)也在人外周血中得到驗(yàn)證。這為輻射導(dǎo)致的免疫抑制提出了新的思路。
　　為了進(jìn)一步了解免疫系統(tǒng)輻射損傷的分子機(jī)制，并開(kāi)發(fā)高效、低毒的輻射防護(hù)手段。我們一方面探討了分子氫的輻射防護(hù)效果，發(fā)現(xiàn)分子氫很好的

38、保護(hù)了γ射線(xiàn)和重離子照射導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)損傷。關(guān)于γ射線(xiàn)輻射生物學(xué)研究較多，亞致死劑量γ射線(xiàn)照射過(guò)的小鼠第一天到第三天，脾臟和胸腺等免疫器官迅速縮小，免疫細(xì)胞大量凋亡或釋放入血。重離子輻射屬于高LET輻射，常見(jiàn)于空間輻射、核電站泄露等情況，主要特點(diǎn)是射線(xiàn)電離能力強(qiáng)，傳遞能量大等特點(diǎn)，生物效能較大。我們發(fā)現(xiàn)分子氫可以明顯減少γ射線(xiàn)和重離子照射導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期紊亂等。目前認(rèn)為其機(jī)制與抗氧化應(yīng)激、清除自由基有關(guān)。近期的研究表明，分子氫可

39、能是作為信號(hào)分子而發(fā)揮作用，并發(fā)現(xiàn)它對(duì)LPS/IFNc，JNK和NFκ-B等信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)作用，我們也發(fā)現(xiàn)分子氫處理后，caspase3的活性明顯減弱。另一方面，我們以WRN蛋白磷酸化為切入點(diǎn)探討了細(xì)胞輻射損傷的分子機(jī)制，篩選出輻射誘導(dǎo)的WRN蛋白S1141磷酸化，并發(fā)現(xiàn)S1141A突變型細(xì)胞發(fā)生了明顯的G2周期阻滯。首先我們發(fā)現(xiàn)輻射導(dǎo)致的WRN蛋白S1141位點(diǎn)磷酸化主要依賴(lài)于ATM的表達(dá)和磷酸化，而不依賴(lài)DNA-PKcs。然后我們

40、從細(xì)胞輻射敏感性、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA損傷修復(fù)通路等方面探討了WRN蛋白S1141位點(diǎn)磷酸化在輻射損傷中的作用。發(fā)現(xiàn)這一位點(diǎn)的失活型突變細(xì)胞1141A細(xì)胞，輻射敏感性有所提高，細(xì)胞周期阻滯明顯，難以恢復(fù)。然后我們發(fā)現(xiàn)在S1141位點(diǎn)失活型突變細(xì)胞中，照后p53磷酸化水平迅速增加，并不隨時(shí)間降低，這與我們細(xì)胞周期的變化趨勢(shì)一致。這些結(jié)果說(shuō)明p53在輻射導(dǎo)致的WS和1141A細(xì)胞周期阻滯中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用但深入機(jī)制還需要繼續(xù)探討。

41、>　　總之，本研究發(fā)現(xiàn)全身照射促進(jìn)皮膚DC向淋巴結(jié)的遷移，導(dǎo)致小鼠CD8+DC和CD8-DC亞型失衡，并發(fā)現(xiàn)其可能與Th1/Th2偏移有關(guān)。通過(guò)研究分子氫對(duì)免疫細(xì)胞的輻射防護(hù)作用，我們發(fā)現(xiàn)其對(duì)不同LET射線(xiàn)照射的損傷，都具有很好的輻射防護(hù)作用，并對(duì)其作用機(jī)制做了初步探討。為了更深入的了解輻射導(dǎo)致細(xì)胞損傷的分子機(jī)制，我們探討并發(fā)現(xiàn)了WRN蛋白S1141位點(diǎn)磷酸化在照后細(xì)胞周期阻滯的恢復(fù)中具有關(guān)鍵作用。本研究為明確免疫系統(tǒng)的輻射損傷效應(yīng)及其