造血系統(tǒng)輻射損傷防護(hù)和腫瘤放療增敏研究.pdf

1、第一部分，骨髓抑制是輻射損傷的主要表現(xiàn)，也是臨床進(jìn)行腫瘤放療時(shí)最常見(jiàn)的副作用。骨髓幼稚型造血細(xì)胞(hematopoieticprogenitorcells，HPCs)對(duì)缺血應(yīng)激產(chǎn)生快速增殖反應(yīng)，受到輻射損傷后引起急性骨髓抑制；造血干細(xì)胞(hematopoieticstemcell，HSC)具有自我更新、增殖、分化生成全血細(xì)胞的功能，受損后引起骨髓持久抑制甚至個(gè)體死亡，目前臨床上缺乏有效的治療手段。白藜蘆醇(Resveratrol，Rev

2、)是一種非黃酮多酚類化合物，具有抗氧化、抗衰老、抗凋亡的作用，其對(duì)造血系統(tǒng)輻射損傷的防護(hù)作用還未見(jiàn)報(bào)道。我們系統(tǒng)研究了白藜蘆醇對(duì)造血系統(tǒng)輻射損傷的防護(hù)作用并探討其機(jī)制
　　 在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中，白藜蘆醇對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNCs)、造血祖細(xì)胞(HPCs)和造血干細(xì)胞(HSCs)都具有輻射損傷防護(hù)作用。在30天生存周期實(shí)驗(yàn)中，白藜蘆醇對(duì)致死劑量全身照射小鼠具有提高生存率的作用。在整體學(xué)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)白藜蘆醇的造血系統(tǒng)輻射損傷的防護(hù)作用

3、進(jìn)行了系統(tǒng)研究。在數(shù)量上，外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)、造血細(xì)胞計(jì)數(shù)均表明白藜蘆醇對(duì)造血系統(tǒng)輻射損傷具有防護(hù)作用。在功能上，CAFC實(shí)驗(yàn)表明白藜蘆醇對(duì)輻射損傷的HPC和HSC具有防護(hù)作用，競(jìng)爭(zhēng)移植實(shí)驗(yàn)表明，白藜蘆醇可以提高輻射損傷小鼠HSC長(zhǎng)期再植能力。我們還對(duì)防護(hù)機(jī)制進(jìn)行了深入研究，對(duì)HSC的p16mRNA表達(dá)和凋亡水平的研究表明，白藜蘆醇對(duì)造血系統(tǒng)輻射損傷的防護(hù)作用與改善輻射誘導(dǎo)HSC的的衰老相關(guān)，而與凋亡途徑無(wú)關(guān)；DCF染色實(shí)驗(yàn)表

4、明，白藜蘆醇可以改善輻射誘導(dǎo)的HSC氧化應(yīng)激，與改善HSC衰老水平有關(guān)；qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明，白藜蘆醇可以降低NOX4的mRNA表達(dá)水平，提高SOD2和GPX1的表達(dá)水平，與降低HSC的氧化應(yīng)激水平相關(guān)。
　　 總之我們的工作首次系統(tǒng)地研究了白藜蘆醇對(duì)造血系統(tǒng)輻射損傷的防護(hù)作用。我們的研究闡明了Rev對(duì)造血祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞具有輻射損傷防護(hù)作用；闡明了這一防護(hù)作用與Rev降低造血干細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和衰老相關(guān)；闡明了降低造血干細(xì)

5、胞氧化應(yīng)激水平與Rev調(diào)節(jié)氧化．應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)相關(guān)。我們的研究提示白藜蘆醇有可能成為臨床上造血系統(tǒng)輻射損傷防護(hù)劑，對(duì)改善腫瘤放療患者預(yù)后、提高意外輻射事故受害人員生存率、改善輻射相關(guān)工作人員健康水平都具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　 第二部分，背景：視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Retinoblastoma，RB)基因是最早克隆出來(lái)的人類腫瘤抑制基因，主要生理作用是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，Rb基因的缺失和突變將引起腫瘤的發(fā)生。利用病毒轉(zhuǎn)染Rb基因可

6、以起到抑制Rb突變/缺失腫瘤生長(zhǎng)的作用，但野生型Rb蛋白（RB110）容易磷酸化失活，基因轉(zhuǎn)染治療效果有限。近期研究發(fā)現(xiàn)，N端缺失112個(gè)氨基酸殘基的Rb蛋白-pRB94對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系具有比pRB110更強(qiáng)的腫瘤抑制效應(yīng)。放射治療是臨床上食道上皮細(xì)胞癌治療的重要方法，但過(guò)高的治療劑量對(duì)正常組織也有損傷，將基因治療與放療聯(lián)合使用可以降低總照射劑量，提高治療效果，改善患者預(yù)后。
　　 目的：研究在體內(nèi)和體外水平利用腺病毒轉(zhuǎn)染RB9

7、4基因聯(lián)合放射對(duì)食管鱗狀癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的抑制作用。
　　 材料和方法：在體外水平，我們培養(yǎng)了Kyse150細(xì)胞，用Ad-RB94進(jìn)行轉(zhuǎn)染，合并IR干預(yù)，設(shè)置Ad-LacZ轉(zhuǎn)染對(duì)照和空白對(duì)照，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平，用PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期，用AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)凋亡水平，用qRT-PCR法評(píng)估RB94的轉(zhuǎn)染效果；體內(nèi)種植瘤實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)移植腫瘤生長(zhǎng)至35mm3時(shí)進(jìn)行分組，我們連續(xù)4次對(duì)腫瘤進(jìn)行Ad-RB94轉(zhuǎn)染和照射，設(shè)

8、置Ad-LacZ轉(zhuǎn)染對(duì)照和空白對(duì)照腫瘤，對(duì)腫瘤體積進(jìn)行連續(xù)測(cè)量。在分組第18d，處死小鼠，收獲腫瘤制作石蠟塊，切片H.E.染色組織學(xué)分析各組腫瘤的生長(zhǎng)情況，免疫組織化學(xué)法用RB抗體檢測(cè)RB94的轉(zhuǎn)染效果，用Ki67表達(dá)評(píng)估各組腫瘤細(xì)胞的增殖活力；用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡水平。
　　 結(jié)果：首先我們確定了Ad-RB94能有效轉(zhuǎn)染RB94基因。在體外實(shí)驗(yàn)中，用qRT-PCR方法闡明了腺病毒載體可以有效轉(zhuǎn)染RB94基因，并在Kys

9、e150細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中用免疫組化法闡明了Ad-RB94可以有效轉(zhuǎn)染并持續(xù)表達(dá)。為闡明Ad-RB94增強(qiáng)IR對(duì)ESCC的生長(zhǎng)抑制作用，我們進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。在腫瘤移植實(shí)驗(yàn)中，各組腫瘤的體積得到連續(xù)的測(cè)量并計(jì)算，生長(zhǎng)曲線表明，IR對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有抑制作用，而Ad-RB94可以增強(qiáng)IR對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)抑制作用。此外，小鼠處死后收獲的抑制腫瘤進(jìn)行了組織學(xué)分析，H.E.染色切片鏡下觀察，分析了腫瘤包膜、細(xì)胞異型性、核分裂相、凋亡小體和核染

10、色等指標(biāo)，腫瘤的最大橫截面積也得到計(jì)算，結(jié)果提示Ad-RB94可以增強(qiáng)IR對(duì)食道鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)的生長(zhǎng)抑制作用。Ki67在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)水平用免疫組化法進(jìn)行了檢測(cè)，并進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明，IR和Ad-RB94均具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性的作用，并進(jìn)一步闡明了Ad-RB94可以增強(qiáng)IR對(duì)ESCC的生長(zhǎng)抑制作用。為闡明Ad-RB94可以增強(qiáng)IR對(duì)ESCC的生長(zhǎng)抑制作用的機(jī)制，還在體外水平進(jìn)行了細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，在體內(nèi)和體外水平進(jìn)行了

11、細(xì)胞凋亡水平檢測(cè)。結(jié)果表明，Kyse150細(xì)胞轉(zhuǎn)染RB94后對(duì)細(xì)胞周期并沒(méi)有顯著影響，但可以提高腫瘤細(xì)胞的凋亡率，提示Rb94對(duì)ESCC腫瘤IR增效作用是通過(guò)促進(jìn)凋亡的途徑，與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期無(wú)關(guān)。
　　 結(jié)論：我們?cè)隗w內(nèi)和體外水平的研究表明，利用腺病毒載體轉(zhuǎn)染RB94基因可以增強(qiáng)IR對(duì)ESCC的生長(zhǎng)抑制作用。研究提示在臨床ESCC的治療中基因轉(zhuǎn)染RB94有望提高放療的抑瘤效果，降低總照射劑量，降低對(duì)正常組織的損傷，提高患者的預(yù)后或