HBV宮內(nèi)感染體外模型的構(gòu)建及cAMP調(diào)控子宮肌細(xì)胞COX-2表達(dá)的機(jī)制研究.pdf

1、一
　　HBV宮內(nèi)感染體外模型的構(gòu)建
　　乙型肝炎是中國(guó)的流行病之一，全世界有3.5人口感染乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)，其中至少有1/3在中國(guó)。中國(guó)目前有約3000萬(wàn)慢性乙肝患者和1.2億無(wú)癥狀的攜帶者。作為全球免疫疫苗聯(lián)盟計(jì)劃的一部分，中國(guó)最窮困的省份中至少有1千1百多萬(wàn)人口已經(jīng)接種到了乙肝疫苗，但是這遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到免疫及控制乙型肝炎病毒的傳播的程度。盡管大部分的研究人員認(rèn)同胎兒感染及新生兒早期的垂

2、直傳播是HBV傳播的主要途徑和方式，但是由于具體機(jī)制尚不清楚，故在我國(guó)HBV感染的高危因素仍然不能確定。目前，人們把HBV的垂直傳播主要分為3種不同的方式：胎兒的宮內(nèi)感染、產(chǎn)時(shí)感染及產(chǎn)后感染。對(duì)于后兩種傳播途徑而言，HBV疫苗和免疫球蛋白的應(yīng)用可以有效阻止其傳播。因此，更好地了解宮內(nèi)感染所致的HBV宮內(nèi)傳播對(duì)于明確HBV的傳播途徑是至關(guān)重要的。
　　在整個(gè)妊娠過(guò)程中，胎盤的結(jié)構(gòu)和功能是動(dòng)態(tài)變化。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，胎盤對(duì)于病毒從母

3、體面到胎兒面的垂直傳播中發(fā)揮非常重要的作用，如HBV、HCV、HIV及CMV病毒等。先天性的病毒感染可能引起產(chǎn)后感染、胎兒畸形、甚至是胎兒的死亡。雖然經(jīng)胎盤傳播病毒是這種感染的重要方面，但是關(guān)于病毒經(jīng)胎盤的垂直傳播及胎盤屏障在病毒從母體到胎兒循環(huán)中的傳播中所發(fā)揮的作用研究還非常少。盡管對(duì)于血腦屏障已經(jīng)有了非常深入的研究，但對(duì)于胎盤屏障的建立和鑒定還未見(jiàn)報(bào)道，導(dǎo)致宮內(nèi)感染缺乏一個(gè)可靠的體外研究模型，嚴(yán)重影響病毒宮內(nèi)感染機(jī)制的研究，制約了宮

4、內(nèi)感染的有效治療。因此，構(gòu)建一種胎盤屏障體外模型用于病毒宮內(nèi)感染的研究是當(dāng)前勢(shì)在必行解決的問(wèn)題，從而為病毒宮內(nèi)感染機(jī)制的闡明和治療方法的探索奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　同時(shí)，已經(jīng)被證實(shí)有3個(gè)基本的結(jié)構(gòu)層面：滋養(yǎng)層細(xì)胞、間隙細(xì)胞（主要是胎盤的單核巨噬細(xì)胞，如Hofbauer細(xì)胞）及人胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞參與到宮內(nèi)感染中。胎盤屏障主要由滋養(yǎng)層細(xì)胞、人胎盤微血管內(nèi)皮細(xì)胞及兩者的基底層所構(gòu)成，是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及某些藥物、病毒、激素等從母體進(jìn)入胎兒的必

5、經(jīng)之路。本研究運(yùn)用原代培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC），采用三種不同的模式來(lái)構(gòu)建胎盤屏障的體外模型：滋養(yǎng)層細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，滋養(yǎng)層細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞非接觸性共培養(yǎng)及滋養(yǎng)層細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞接觸性共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)兩者的接觸性共培養(yǎng)是能夠最好的模擬正常胎盤結(jié)構(gòu)和功能的體外胎盤屏障模型；然后我們利用病毒拷貝量高于107/ml HBV患者血清直接感染構(gòu)建的胎盤屏障模型，

6、進(jìn)一步研究HBV病毒穿過(guò)及感染體外胎盤屏障模型的能力。
　　基于HIV及CMV可以通過(guò)受體介導(dǎo)的方式引起宮內(nèi)垂直感染，同時(shí)HBV可以感染外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood monocyte，PBMC），并在其中復(fù)制，我們推測(cè)HBV可能通過(guò)以下3種途徑：1.機(jī)械性損傷：炎性反應(yīng)所致直接或是間接損傷滋養(yǎng)層細(xì)胞或是臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞裂隙，導(dǎo)致基底膜通透性增高，從而HBV可以突破胎盤屏障第一層（滋養(yǎng)層細(xì)胞），然后釋放

7、入絨毛間質(zhì)；2.細(xì)胞傳遞性：感染HBV的PBMC通過(guò)與滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生瞬時(shí)的微融合而將其內(nèi)的HBV傳遞給后者，滋養(yǎng)層細(xì)胞再將HBV極性釋放入絨毛間質(zhì)；3.受體介導(dǎo)性：滋養(yǎng)層細(xì)胞頂膜側(cè)上某種受體可能介導(dǎo)了游離完整HBV顆粒的進(jìn)入并在其中復(fù)制，然后將部分HBV自其基底側(cè)膜極性釋放入絨毛間質(zhì)。
　　由于受體介導(dǎo)病毒入胞是其最常見(jiàn)的入侵細(xì)胞的方式和已經(jīng)證實(shí)HBV在體情況下可以引起胎盤的損傷，所以本研究中，將關(guān)注機(jī)械性損傷和受體介導(dǎo)性病毒感染

8、途徑。HBV受體的探索雖然已經(jīng)有20余年的歷史，先后發(fā)現(xiàn)10余種可能的蛋白質(zhì)，但高親和力的HBV受體尚未發(fā)現(xiàn)。樹突狀細(xì)胞特異的C型外源凝集素(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin，DC-SIGN)通過(guò)甘露糖和海藻糖連接碳水化合物來(lái)識(shí)別病原微生物從而導(dǎo)致抗病毒的免疫反應(yīng)。在許多糖化病毒免疫逃逸的過(guò)程中，DC-SIGN參與

9、病毒進(jìn)入并反式感染細(xì)胞的過(guò)程。同時(shí)，亦有研究證實(shí)其在HIV的母嬰垂直傳播中可能發(fā)揮重要的作用。除了在未成熟的樹突狀細(xì)胞上有分布和表達(dá)外，DC-SIGN也可以在PBMC、胎盤的血管內(nèi)皮細(xì)胞、胎盤巨噬細(xì)胞中表達(dá)。我們前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，DC-SIGN可以在滋養(yǎng)層細(xì)胞上表達(dá)。迄今為止，DC-SIGN作為受體的病毒包括HIV、CMV、埃博拉病毒（Ebola virus）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV），SARS冠

10、狀病毒及麻疹等（未見(jiàn)與HBV的相關(guān)報(bào)道）。所有的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是與病原體的N-高甘露糖型糖鏈特異性結(jié)合，而HBV被膜蛋白的PreS2抗原也存在N-高甘露糖型糖鏈，HBV有與DC-SIGN結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。鑒于DC-SIGN在胎盤上的分布，我們大膽推測(cè)DC-SIGN可能和HBV的宮內(nèi)感染相關(guān)。
　　基于以上分析，本課題首先是利用原代培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建一種胎盤屏障體外模型，并進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)與鑒定；其次，采用HBV病毒感染胎盤

11、屏障體外模型，明確胎盤屏障在HBV宮內(nèi)感染可能的作用；然后應(yīng)用胎盤屏障模型進(jìn)一步研究DC-SIGN在HBV垂直傳播中的可能作用，從而為HBV宮內(nèi)感染機(jī)制研究與治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論如下：
　　1、采用胰酶與DNA酶序貫消化法分離人早孕滋養(yǎng)層細(xì)胞，通過(guò)35％與45％Percoll兩個(gè)梯度的不連續(xù)密度梯度離心對(duì)分離細(xì)胞加以純化，使細(xì)胞產(chǎn)量達(dá)106/g以上。然后用抗HLA-DR的免疫磁珠進(jìn)一步純化早孕的絨毛

12、滋養(yǎng)層細(xì)胞。應(yīng)用細(xì)胞角蛋白和波形蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞純度達(dá)到90％以上，可從數(shù)量及純度上滿足后續(xù)體外感染要求。利用HUVEC和絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞接觸共培養(yǎng)構(gòu)建胎盤屏障體外模型，掃描電鏡結(jié)果顯示滋養(yǎng)層細(xì)胞穿過(guò)Tranwell小室，與HUVEC接觸性共生長(zhǎng)；透射電鏡和激光共聚焦結(jié)果表明屏障構(gòu)建后，細(xì)胞之間存在大量緊密連接；跨膜電阻檢測(cè)發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的胎盤屏障能有效提高跨膜電阻；因此，構(gòu)建的體外模型從功能和形態(tài)符合胎盤屏障的要求，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠

13、定基礎(chǔ)。
　　2、采用血清直接感染法進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞的HBV感染，模擬自然狀態(tài)下HBV分別感染胎盤屏障中的滋養(yǎng)層細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，然后感染構(gòu)建的胎盤體外屏障，探討HBV感染胎盤屏障的可能性。結(jié)果顯示HBV DNA在感染后的滋養(yǎng)層細(xì)胞及HUVEC的上清液中釋放分別在72-96h及48-72h達(dá)到高峰。分別應(yīng)用HBsAg、與CK7及Ⅷ相關(guān)抗原、HBcAg與CD105進(jìn)行免疫組化雙標(biāo)染色，發(fā)現(xiàn)HBV可以感染人滋養(yǎng)層細(xì)胞和HUVEC及胎盤屏障

14、的體外模型。而且胎盤屏障可以部分阻止HBV穿透母體面至胎兒面，所以在感染后的24h，共培養(yǎng)體系的外室上清液中HBV DNA僅能一過(guò)性的達(dá)到103/ml。嘗試用不同檢測(cè)法（傳統(tǒng)的PCR法、Hirt法及質(zhì)粒抽提法）檢測(cè)感染HBV復(fù)制的金標(biāo)準(zhǔn)HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），感染HBV后的胎盤屏障未能檢測(cè)出HBV cccDNA，所以HBV在胎盤屏障中是一過(guò)性的感染還是可以復(fù)

15、制，尚沒(méi)有定論。但至少，掃描電鏡中我們?cè)贖BV感染后的體外模型中發(fā)現(xiàn)了HBV病毒樣的顆粒。
　　3、分別采用DC-SIGN抗體及siRNA基因沉默DC-SIGN試驗(yàn)，初步探討DC-SIGN在HBV宮內(nèi)傳播中的作用，發(fā)現(xiàn)DC-SIGN抗體及RNA小片段干擾技術(shù)基因沉默DC-SIGN在HBV感染滋養(yǎng)層細(xì)胞和HUVEC的過(guò)程中有阻斷作用，但對(duì)于體外構(gòu)建的胎盤屏障阻斷作用未見(jiàn)明顯差異。進(jìn)一步通過(guò)受體DC-SIGN重建，利用DC-SIGN質(zhì)

16、粒轉(zhuǎn)染人胎肝細(xì)胞驗(yàn)證DC-SIGN增加了人胎肝細(xì)胞HBV易感性，故DC-SIGN是HBV經(jīng)受體介導(dǎo)性進(jìn)入胎盤屏障的宮內(nèi)傳播中的可能受體之一。
　　以上結(jié)果表明，我們第一次成功構(gòu)建了人胎盤屏障體外培養(yǎng)模型，也證實(shí)HBV可能從滋養(yǎng)層面向內(nèi)皮細(xì)胞面穿過(guò)；盡管屏障本身對(duì)于病毒的侵入起到一定的阻斷作用，HBV DNA在細(xì)胞共培養(yǎng)體系中仍然有一過(guò)性的增高；同時(shí)，高拷貝量的HBV病毒對(duì)于HUVEC有機(jī)械性損傷，但是共培養(yǎng)中未發(fā)現(xiàn)同樣的現(xiàn)象；初步

17、探討通過(guò)DC-SIGN這個(gè)受體介導(dǎo)HBV入侵滋養(yǎng)層細(xì)胞的宮內(nèi)傳播的機(jī)制，旨在為HBV宮內(nèi)感染機(jī)制的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為宮內(nèi)干預(yù)提供新的靶標(biāo)。
　　二
　　cAMP調(diào)控子宮肌細(xì)胞COX-2表達(dá)的機(jī)制研究
　　早產(chǎn)是臨床上新生兒致死或是致畸的主要原因之一。盡管在過(guò)去20年中，對(duì)于早產(chǎn)已展開(kāi)了深入的實(shí)驗(yàn)室和臨床研究，其發(fā)生率仍然增高超過(guò)30％。早產(chǎn)發(fā)生主要是產(chǎn)程過(guò)早發(fā)動(dòng)，其主要原因有宮內(nèi)感染、子宮過(guò)度牽張和胎盤早剝。正是這些

18、臨床病理因素將子宮從靜息狀態(tài)變?yōu)槭湛s，從而導(dǎo)致分娩的發(fā)動(dòng)。
　　3',5'-環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）作為經(jīng)典的第二信使，影響了一系列的人體生理和病理反應(yīng)，包括平滑肌的收縮和炎癥反應(yīng)。事實(shí)上，不僅生理狀態(tài)下產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)（如松弛素、促腎上腺皮質(zhì)激素分泌激素及降鈣素基因相關(guān)肽），就連病理狀態(tài)下產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)（如β2腎上腺素激動(dòng)劑）均是通過(guò)cAMP引發(fā)子宮舒張。但是，臨床上我們也

19、發(fā)現(xiàn)除了藥物本身的對(duì)人體的副作用和快速抗藥物反應(yīng)外，其可能下調(diào)人體內(nèi)?2腎上腺素激動(dòng)劑受體的表達(dá)。所以，需要尋找才一種新的可以增高cAMP水平的其他機(jī)制，最近在對(duì)于小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，磷酸二酯酶4型抑制劑——rolipram，可以降低早產(chǎn)的發(fā)生。
　　前列腺素(prostaglandins，PGs)對(duì)于早產(chǎn)和足月產(chǎn)產(chǎn)程發(fā)動(dòng)，宮頸成熟和促進(jìn)子宮肌收縮都發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用。在臨床治療中，這些特性一方面用于誘導(dǎo)分娩的發(fā)生，另一方面前列腺素

20、合成酶抑制劑又應(yīng)用于抑制早產(chǎn)的發(fā)生。目前已知環(huán)氧合酶至少有3種不同亞型在子宮平滑肌上表達(dá)，而表達(dá)最多的環(huán)氧合酶2型。環(huán)氧合酶-2(cyclo-oxygenase-2，COX-2)常被轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上被調(diào)控，能被生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子及內(nèi)毒素刺激增高；在產(chǎn)程發(fā)動(dòng)后，子宮肌和羊膜層中COX-2的表達(dá)均上調(diào)。我們前面實(shí)驗(yàn)中研究證實(shí)炎性細(xì)胞因子IL-1β可以通過(guò)NF-κB增高COX-2的表達(dá)，而且IL-1β和牽張也可以通過(guò)MAPK上調(diào)COX-2的