新型肝炎病毒感染體系構建及抗病毒先天免疫應答研究.pdf

1、全球有超過5億人口屬于丙型肝炎病毒（HCV）和/或乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染人群，這些感染者有可能逐步發(fā)展為慢性肝炎、肝硬化和肝癌。因缺少理想的病毒感染體系而制約了病毒生活周期、先天免疫反應以及發(fā)病機制的相關研究，從而阻礙了研發(fā)抗病毒藥物的進程。盡管乙肝病毒的預防性疫苗早已上市，HCV疫苗卻還未研發(fā)成功。相比于其它大部分的病毒感染，HCV感染的主要特征是極易形成慢性感染（約80％）。另一方面，約有20%的HCV感染者能夠自動清除體內(nèi)

2、病毒而不需要接受治療，表明宿主的先天免疫反應可以控制病毒感染。
　　在病毒感染過程中，誘導 I型干擾素和干擾素刺激基因（ISGs）是宿主抵御病毒的主要方式。宿主通過模式識別受體（PRRs）捕獲病毒感染所形成的病原體相關分子模式（PAMPs），激活先天免疫應答系統(tǒng)。主要的PRRs包括RIG-I樣受體（RLRs）、Toll樣受體（TLRs）、Nod樣受體（NLRs）和蛋白激酶R（PKR）。然而，HCV和肝細胞抗病毒先天免疫反應之間的復

3、雜相互作用機制未知。本研究工作旨在研發(fā)一個理想的HCV和HBV感染細胞培養(yǎng)體系，并基于此體系探究宿主應答病毒感染的先天免疫機制。
　　第一，成功分離了一株新型肝癌細胞系 HLCZ01。該細胞系來源于一位患有高分化肝癌的男性病人的肝組織。HLCZ01細胞的形態(tài)酷似人正常原代肝細胞（PHH），并表達多種肝細胞特異性標志物，包括白蛋白（ALB）、α1-抗胰蛋白酶（AAT）、肝細胞核因子4（HNF4）、細胞色素 CYP3A4和miR-12

4、2。同時，HLCZ01細胞還表達HCV的四種受體，分別為CD81、SR-BI、CLDN1和OCLN。
　　第二，HLCZ01細胞系支持HCV和HBV感染的完整生活周期。HLCZ01細胞既支持實驗室來源和臨床病人血清中的HCV感染和復制，又支持體外來源的和體內(nèi)病人血清來源的HBV感染和復制。從病毒感染的HLCZ01細胞中組裝和釋放的HBV和HCV可以再感染原始的HLCZ01細胞。 HLCZ01細胞支持HBV和HCV共感染，并且這兩種

5、肝炎病毒在HLCZ01細胞中的復制互不干擾?？笻BsAg和抗CD81特異性抗體可分別阻斷HBV和HCV入侵 HLCZ01細胞。已開發(fā)的抗病毒藥物可有效抑制HBV和HCV在HLCZ01細胞中的復制。HLCZ01是世界首例支持HBV和HCV病人血清直接感染以及 HBV/HCV共感染的肝癌細胞系，這株細胞系可應用于肝炎病毒生活周期、肝細胞與肝炎病毒相互作用的研究以及抗病毒藥物和疫苗的研發(fā)。
　　第三，HLCZ01細胞和PHH具有完整的先

6、天免疫應答系統(tǒng)。一方面，HCV感染肝細胞后可誘導 IFN-β和G1P3、ISG12a以及1-8U等抗病毒 ISGs的表達。在HLCZ01細胞中，HBV的存在并不影響 HCV誘導 IFN-β和ISGs的產(chǎn)生。另一方面，HCV感染 HLCZ01細胞和PHH至相對較長時間點時，可誘導病毒感染細胞凋亡，這可能是宿主細胞清除病毒的另一種先天免疫應答方式。在肝細胞中沉默TRAIL可抑制HCV誘導的細胞凋亡。RIG-I缺失可下調(diào)IFN-β和TRAIL

7、的表達，并阻斷病毒誘導的細胞凋亡，從而促進病毒復制。IRF3是RIG-I的下游信號分子，同樣參與了TRAIL介導的肝細胞凋亡。
　　第四，miR-942通過調(diào)控 ISG12a表達以介導 HCV誘導的細胞凋亡。借助于HLCZ01細胞感染體系，找到了介導 HCV所致細胞凋亡的重要調(diào)控分子 ISG12a及其參與HCV誘導細胞凋亡的信號通路。經(jīng)生物信息學方法預測和實驗驗證顯示，miR-942是ISG12a的負調(diào)控因子。HCV感染可下調(diào)mi

8、R-942的表達，并且miR-942與 ISG12a在 HCV感染的肝細胞和肝組織中的表達呈負相關性。過表達或沉默miR-942可分別減弱或增強HCV誘導的細胞調(diào)亡。同時，促凋亡蛋白Noxa在HCV感染細胞中被誘導表達，誘導的Noxa可介導ISG12a依賴的肝細胞凋亡。
　　綜上所述，本研究工作構建了一株支持 HCV和HBV完整生活周期的新型肝癌細胞系HLCZ01。借助于該感染體系，初步揭示了若干宿主應答病毒感染的先天免疫反應節(jié)點