豬瘟病毒感染對宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答基因的影響.pdf

1、豬瘟病毒(CSFV)是一種帶有囊膜的單股正鏈RNA病毒，與牛病毒性粘膜腹瀉病毒和羊邊界病毒同屬于黃病毒科瘟病毒屬。豬瘟病毒的基因組大小約12.3 kb，只含有一個(gè)開放閱讀框，編碼一個(gè)由3898個(gè)氨基酸殘基組成的多聚蛋白，該多聚蛋白在宿主細(xì)胞蛋白酶和病毒特異的蛋白酶共同作用下裂解為4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。家豬和野豬是該病毒的唯一宿主，豬瘟病毒引起的豬瘟是一種具有高發(fā)病率和高死亡率的烈性接觸性傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，世界衛(wèi)

2、生組織OIE將其列為A類必須申報(bào)的重要?jiǎng)游飩魅静≈?，我國也將豬瘟定為一類動(dòng)物傳染病，并從2008年起列為動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫項(xiàng)目。
　　 隨著豬瘟疫苗的廣泛使用，改變了豬瘟病毒的生態(tài)環(huán)境，豬瘟在流行特點(diǎn)和發(fā)病特點(diǎn)上發(fā)生了很大的變化，由大流行轉(zhuǎn)變?yōu)榈胤叫粤餍谢蛏l(fā)，臨床癥狀從典型轉(zhuǎn)變?yōu)榉堑湫停霈F(xiàn)母豬繁殖障礙和新生仔豬先天感染。從精液、睪丸、扁桃體和淋巴結(jié)中檢測到豬瘟病毒的存在，甚至在部分免疫了的豬體內(nèi)檢出豬瘟病毒，證實(shí)了豬瘟病毒存

3、在持續(xù)感染現(xiàn)象。病毒要實(shí)現(xiàn)潛伏或持續(xù)性感染，必需逃脫宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，突破宿主抗病毒防衛(wèi)機(jī)制而獲得免疫逃逸。研究豬瘟病毒與宿主之間的相互作用關(guān)系是理解病毒致病機(jī)制及其免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)，豬瘟病毒在宿主體內(nèi)或體外對靶細(xì)胞的影響正是它們相互作用的具體表現(xiàn)。PK-15細(xì)胞是豬瘟病毒體外感染的主要傳代細(xì)胞，探索豬瘟病毒對PK-15細(xì)胞功能的影響，將有助于揭示豬瘟病毒感染的致病機(jī)制。因此，在本研究中應(yīng)用real-time RT-PCR和Wester

4、n blot方法對CSFV感染后宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答基因表達(dá)的變化進(jìn)行了研究，主要結(jié)果如下:
　　 1.建立了檢測豬免疫應(yīng)答基因mRNA表達(dá)水平的real-time RT-PCR方法。
　　 根據(jù)已知的豬源SLA-2、TAP1、SLA-DR、Ii、CD40、CD80、CD86、IFN-α、IFN-β、GAPDH基因和CSFV5'UTR基因片段的mRNA序列，采用生物軟件Oligo6.0和Primer5.0輔助設(shè)計(jì)并合成了1

5、1對特異性引物;以O(shè)ligo(dT)18為引物，合成第一鏈cDNA;以cDNA為模板，分別進(jìn)行11個(gè)目的基因片段的PCR擴(kuò)增;膠回收PCR產(chǎn)物，把它們克隆到pMD18-T載體上并測序;對提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)對熒光定量PCR反應(yīng)的引物濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。應(yīng)用11對引物分別擴(kuò)增出目的基因目的條帶，大小與預(yù)期片段相符合;real-timeRT-PCR反應(yīng)的最佳引物濃度是202.5 nmol/μl

6、，最佳退火溫度是60℃;目的基因real-time RT-PCR融解曲線均顯示單一溶解峰。結(jié)果表明，本試驗(yàn)成功地建立了檢測PK-15細(xì)胞中SLA-2、TAP1、SLA-DR、Ii、CD40、CD80、CD86、IFN-α、IFN-β、GAPDH和CSFV5'UTR基因mRNA表達(dá)動(dòng)態(tài)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。
　　 2.應(yīng)用real-time RT-PCR方法檢測豬瘟病毒感染后不同時(shí)間段的PK-15細(xì)胞中免疫應(yīng)答基因的mRNA轉(zhuǎn)

7、錄情況。
　　 在自然和實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，豬瘟病毒能逃避宿主的免疫系統(tǒng)建立持續(xù)性感染。猜測，與MHC和細(xì)胞因子調(diào)控有關(guān)的一些基因卷入到免疫逃避事件中，但是具體的每一個(gè)基因在感染了CSFV后有什么變化尚不清楚。因此，用不同感染量豬瘟病毒Shimen毒株和GXXJ01毒株分別感染PK-15細(xì)胞，感染后1、3、12、24、36和48 h應(yīng)用real-time RT-PCR方法檢測細(xì)胞中免疫應(yīng)答基因SLA-2、TAP1、SLA-DR、Ii、C

8、D40、CD80、CD86、IFN-α和IFN-β的mRNA表達(dá)動(dòng)態(tài)。結(jié)果顯示，SLA-2、TAP1、SLA-DR、Ii、CD40、CD80和CD86的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)明顯的下調(diào)，其中SLA-DR和Ii的mRNA下調(diào)特別顯著，IFN-α和IFN-β的mRNA表達(dá)沒有明顯變化，表明CSFV可能參與了抑制免疫應(yīng)答基因表達(dá)的機(jī)制。
　　 3.豬瘟病毒感染對宿主細(xì)胞中SLA-DR表達(dá)的影響。
　　 PK-15細(xì)胞感染豬瘟病毒Sh

9、imen毒株后，細(xì)胞內(nèi)SLA-DR蛋白表達(dá)呈現(xiàn)明顯的下調(diào)，在病毒感染后的24和36h檢測不到SLA-DR蛋白，在感染后的48 h檢測到少量的SLA-DR蛋白。為了探討豬瘟病毒誘導(dǎo)的SLA-DR的分子機(jī)制，從豬瘟病毒Shimen毒株中擴(kuò)增出C、Npro和E2基因，將其與真核表達(dá)載體pcDNA3.0連接，成功構(gòu)建了P-C、P-Npro和P-E2重組真核表達(dá)質(zhì)粒。構(gòu)建成功的3個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行體外細(xì)胞表達(dá)，轉(zhuǎn)染后的1、

10、3、12、24、36和48 h檢測細(xì)胞中SLA-DR的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，分別轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒P-E2和P-C后，PK-15細(xì)胞中SLA-DR的轉(zhuǎn)錄水平有所升高;轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒P-Npro后，PK-15細(xì)胞中SLA-DR的表達(dá)在3～24 h顯示升高，24 h后開始下降，36 h后恢復(fù)到與對照組一致的水平;在蛋白質(zhì)水平對PK-15細(xì)胞中SLA-DR蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)分別轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染P-C、P-E2和P-C/P-E2后，細(xì)胞中SLA

11、-DR蛋白的表達(dá)有比較明顯的提高;轉(zhuǎn)染P-C/P-NPro/P-E2后，細(xì)胞中SLA-DR蛋白的表達(dá)量稍有上升;分別轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染P-Npro、P-C/P-Npro、P-NPro/P-E2后，PK-15細(xì)胞中SLA-DR蛋白的表達(dá)明顯下降。表明豬瘟病毒E2和C兩個(gè)基因單獨(dú)或協(xié)同作用對宿主細(xì)胞SLA-DR的下調(diào)表達(dá)沒有顯著影響，Npro基因?qū)K-15細(xì)胞中SLA-DR的表達(dá)有一定的抑制作用。研究認(rèn)為，病毒病的發(fā)生、發(fā)展是多基因、多步驟、多