oxLDL和oxHDL對(duì)C57BL-6J小鼠骨髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞趨化作用和成熟活化的影響.pdf

1、目的: 樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）是體內(nèi)唯一能夠激活初始T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞，它是免疫反應(yīng)的樞紐。動(dòng)脈粥樣硬化（As）是一種脂質(zhì)相關(guān)的慢性免疫炎癥性疾病。近年來(lái)研究顯示，DCs可能影響As的起始和進(jìn)展。已證明多種與As相關(guān)的抗原物質(zhì)可誘導(dǎo)DCs的成熟，而DCs的成熟是其作用完全發(fā)揮的必要條件。本實(shí)驗(yàn)從C57BL/6J小鼠骨髓中分離培養(yǎng)DCs，研究LDL和HDL發(fā)生氧化后，對(duì)DCs趨化作用和成熟活化的影響；確定oxLDL和oxHDL作為

2、自身抗原，引起DCs的遷移和成熟活化，導(dǎo)致局部的免疫反應(yīng)和As的起始。 方法: 頸椎脫位法處死C57BL/6J小鼠，取股骨和脛骨，剔除周?chē)∪?，離斷干骺端后，用注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，獲得單細(xì)胞懸液。利用動(dòng)物樹(shù)突狀細(xì)胞專(zhuān)用分離液和細(xì)胞黏附性差異去除大部分巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，用rmGM-CSF和rmIL-4誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞向DCs分化，并抑制淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)。隔天半量換液，補(bǔ)足所需細(xì)胞因子和培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第

3、7天，輕輕吹打收獲，即為未成熟的骨髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDCs)。從形態(tài)學(xué)、分子標(biāo)志表達(dá)和抗原提呈功能三方面聯(lián)合鑒定：（1）光鏡觀察BMDCs生長(zhǎng)過(guò)程中形態(tài)變化；掃描電鏡拍攝成熟和未成熟BMDCs的形態(tài)；并粗略計(jì)數(shù)具有突起樣細(xì)胞的百分比；（2）免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)合檢測(cè)3種以上的BMDCs表面標(biāo)志物的表達(dá)；（3）混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）反映BMDCs提呈抗原的能力。用濃度分別為50μg/ml的oxLDL和oxHDL處理BMDCs，同

4、時(shí)設(shè)立同源蛋白的對(duì)照（分別為50μg/ml LDL和50μg/ml HDL）和陰性（PBS）、陽(yáng)性對(duì)照（1μg/ml LPS）。采用Transwell遷移系統(tǒng)，觀察各實(shí)驗(yàn)組處理因素對(duì)BMDCs趨化作用的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組BMDCs CD86和MHCⅡ的表達(dá)率；液體閃爍計(jì)數(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組BMDCs刺激同源的性T細(xì)胞增殖的能力；將獲得的各組BMDCs注射到C57BL/6J小鼠腹腔，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)遷移到脾臟的BMDCs數(shù)目，體內(nèi)間接證

5、明各處理因素對(duì)BMDCs成熟的影響。 結(jié)果: C57BL/6J小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞在rmIL-4和rmGM-CSF刺激下，符合DCs生長(zhǎng)的一般規(guī)律，即從第3天開(kāi)始，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)閳A形或者類(lèi)圓形，半貼壁，呈“葡萄串”或者呈簇生長(zhǎng)；其中還可見(jiàn)到少量長(zhǎng)突起的雜細(xì)胞。培養(yǎng)至第7天，大量細(xì)胞出現(xiàn)類(lèi)圓形或者不規(guī)則形態(tài)。以LPS刺激成熟后，掃描電鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞突起更加明顯，免疫熒光發(fā)現(xiàn)表達(dá)33D1和CD11c的細(xì)胞數(shù)均達(dá)到80％以上；流式細(xì)胞

6、術(shù)檢測(cè)CD86和MHCⅡ的細(xì)胞表達(dá)率分別為99.0％和32.5％；混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)提示成熟的BMDCs能明顯刺激同源T細(xì)胞的增殖。因此，獲得的細(xì)胞基本符合實(shí)驗(yàn)所需。 實(shí)驗(yàn)分為PBS陰性對(duì)照組、LDL組、oxLDL組、HDL組、oxHDL組和LPS陽(yáng)性對(duì)照組，采用Transwell遷移系統(tǒng)模擬細(xì)胞跨血管壁過(guò)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PBS對(duì)照組相比，除LDL組外，發(fā)生遷移的細(xì)胞明顯增加，氧化修飾性脂蛋白比相應(yīng)的脂蛋白更能趨化BMDCs發(fā)生移

7、動(dòng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD86和MHCⅡ的表達(dá)率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別與LDL、HDL相比，oxLDL、oxHDL能明顯促進(jìn)CD86（84.7％vs68.7％和90.8％vs73.8％）和MHCⅡ（26.0％vs15.2％和25.9％vs11.4％）表達(dá)，但仍低于LPS刺激組（99.0％和32.5％）。同樣，氧化脂蛋白刺激的BMDCs組能更好地促進(jìn)同源T細(xì)胞的增殖(cpm值：992±150.00vs 645±21.17；996.3±212.81v

8、s652±50.59)和細(xì)胞因子（IL-12和IL-10）的分泌。而且oxLDL和oxHDL誘導(dǎo)的BMDCs更接近LPS刺激的成熟狀態(tài)，LDL和HDL誘導(dǎo)的BMDCs成熟分子標(biāo)志和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)都明顯低于LPS組，其成熟只能達(dá)到一種“半成熟”狀態(tài)。體內(nèi)遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)了同樣的結(jié)果，以氧化修飾性脂蛋白處理的BMDCs在24小時(shí)內(nèi)遷移到脾臟的細(xì)胞數(shù)目更多(細(xì)胞百分?jǐn)?shù)：5％vs2％；8％vs2％)。 結(jié)論: （1）分別與LDL和

9、HDL相比，oxLDL、oxHDL更能趨化C57B/6J小鼠BMDCs向Transwell下室移動(dòng)，提示氧化性脂蛋白可能直接趨化DCs進(jìn)入血管內(nèi)膜。 （2）oxLDL、oxHDL處理的C57B/6J小鼠BMDCs ，其CD86和MHCⅡ的表達(dá)、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和細(xì)胞因子（IL-12和IL-10）分泌都明顯升高；提示氧化性脂蛋白更能促進(jìn)BMDCs的成熟活化。 （3）將oxLDL、oxHDL處理的BMDCs回輸?shù)紺57B/6