BmK IA對(duì)C-,57-BL-6小鼠體內(nèi)主要免疫細(xì)胞的活化作用.pdf

1、目的：現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)的發(fā)展，使人們認(rèn)識(shí)到免疫系統(tǒng)的紊亂不僅會(huì)產(chǎn)生多種疾病，而且與人體衰老及老年人的多發(fā)病如腫瘤，高血壓、糖尿病甚至精神病的發(fā)生均有密切關(guān)系。艾滋病(AIDS)的危害，使人們對(duì)免疫缺損的嚴(yán)重后果有了更深刻的認(rèn)識(shí)，因此尋找具有良好免疫調(diào)節(jié)作用的藥物已成為當(dāng)代新藥的發(fā)展方向之一。對(duì)中草藥免疫學(xué)研究已有數(shù)十年的歷史，前階段的研究多以中草藥對(duì)免疫指標(biāo)的增強(qiáng)或抑制為準(zhǔn)繩，確定其對(duì)免疫功能的效應(yīng)。近年來(lái)人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)

2、到，探討中草藥在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮作用的部位及其對(duì)機(jī)體免疫網(wǎng)絡(luò)影響的重要性。 蝎毒素的藥用研究是由于全蝎作為傳統(tǒng)的動(dòng)物性中藥材在我國(guó)已有上千年歷史。在《本草綱目》、《本經(jīng)逢源》、《開(kāi)寶本草》及《醫(yī)林篡要》等傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)經(jīng)典中記載，全蝎有活血化淤、攻毒散結(jié)、趨風(fēng)止痛等功效。近年來(lái)對(duì)全蝎藥理作用的研究已確認(rèn)其藥效成分集中在蝎毒中，并在其藥理、藥效學(xué)研究方面取得了很大進(jìn)展。東亞鉗蝎(Buthus martcnsii Karsch,BmK)是廣泛分

3、布在我國(guó)中西部地區(qū)的蝎種，其蝎尾提取液蝎毒是一種毒性?xún)H次于蛇毒的生物毒素(Buthus martcnsiiKarsch Immunc Active，Bmk IA)，因具有復(fù)雜的成分及性質(zhì)而產(chǎn)生多種生理、藥理活性。蝎毒的抗腫瘤、抗風(fēng)濕、抗癲癇以及對(duì)心血管病等方面的作用已被多位學(xué)者所證實(shí)，并有學(xué)者研究顯示，蝎毒在做輔助治療的同時(shí)具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、減少其它藥物毒副作用之功效，卻未見(jiàn)蝎毒作為免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)機(jī)體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的相關(guān)報(bào)道<'[42

4、,61]>。2005年國(guó)外報(bào)道在了解中毒病理機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)蝎毒某組分(Titvus serrulatus scorpion vcnom,TSV)對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞分泌(TNF-α、IL-1、IL-1β等)功能有調(diào)節(jié)作用，尤其組分Ⅱ(FⅡ)是巨噬細(xì)胞分泌TNF的強(qiáng)化因子；本課題組在前期的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)：蝎毒分離組分Ⅲ(Scorpion venom crude,SVCⅢ)微小劑量下對(duì)體外培養(yǎng)的人類(lèi)急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系JurakatE6-1細(xì)胞

5、的淋巴轉(zhuǎn)化有促進(jìn)作用(JurakatcE6-1可作為研究T淋巴細(xì)胞活化條件的模型)，且對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)α-腫瘤壞死因子(TNF-α)的產(chǎn)生有促進(jìn)作用。以上結(jié)果提示：BmKIA可能是一種生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，并通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能來(lái)發(fā)揮抑殺腫瘤細(xì)胞作用。有學(xué)者對(duì)其生物及生化學(xué)研究顯示出蝎種屬的遺傳與毒素結(jié)構(gòu)的同源性，而且蝎毒多肽的結(jié)構(gòu)特征與一些細(xì)胞因子相像，大量的免疫細(xì)胞因子中含有類(lèi)似的一級(jí)結(jié)構(gòu)，(如趨化性細(xì)胞因子等)，BmK IA是否象某

6、些細(xì)胞因子一樣也對(duì)免疫細(xì)胞發(fā)揮激活或調(diào)節(jié)作用呢?Bmk IA是如何發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的，免疫作用靶點(diǎn)是什么，Bmk IA引起了什么樣的免疫網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系等問(wèn)題還無(wú)相關(guān)的明確解釋。 本研究通過(guò)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，探討B(tài)mK IA在活體內(nèi)對(duì)四類(lèi)主要免疫細(xì)胞(單核、NK、T、B細(xì)胞)的活化作用，從不同免疫細(xì)胞活化時(shí)相了解藥物可能的作用靶細(xì)胞及活化動(dòng)力學(xué)變化；進(jìn)而探討不同用藥方式對(duì)BmK IA免疫活化作用的影響；為揭示Bm

7、k IA在免疫網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用機(jī)制建立理論基礎(chǔ)。 方法：1.經(jīng)小鼠尾靜脈一次性注射有效劑量BmK IA后，在不同時(shí)段(2h、8h、12h、24h)取外周血，用特異性熒光抗體分別標(biāo)記外周血單核、NK、T、B細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)四種主要免疫細(xì)胞共同活化標(biāo)志CD69<'+>的表達(dá)率，繪制CD69<'+>表達(dá)的時(shí)效曲線，研究體內(nèi)免疫細(xì)胞活化動(dòng)力學(xué)變化，探明BmK IA作用的免疫細(xì)胞種類(lèi)及其活化時(shí)段。2.采用尾靜脈注射和腹腔注射兩

8、種用藥方法，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合特異性免疫熒光標(biāo)記法，觀察有效濃度BmK IA對(duì)小鼠外周血4種主要免疫細(xì)胞的免疫活化作用，進(jìn)一步了解不同用藥方式對(duì)BmK IA發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的影響。 結(jié)果：1.靜脈注射1/60半數(shù)致死量的BmK IA溶液，分別在不同時(shí)段流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血5種免疫細(xì)胞CD69陽(yáng)性率：各種細(xì)胞與其對(duì)照組比較均具顯著性差異(P<0.05)，以CD8<'+>T細(xì)胞最高，其次為NK細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞，注射后2小時(shí)

9、開(kāi)始升高，8小時(shí)達(dá)高峰，12小時(shí)開(kāi)始下降。對(duì)CD4<'+>T細(xì)胞作用不明顯。2.采用腹腔和靜脈注射兩種不同用藥方式，流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血免疫細(xì)胞CD69陽(yáng)性率，通過(guò)分析得出：兩種用藥方式BmK IA對(duì)CD8<'+>T細(xì)胞和B細(xì)胞均具活化作用，且效果相當(dāng)；靜脈注射BmK IA對(duì)NK細(xì)胞活化作用較腹腔注射起效塊、活化率幅度高；腹腔注射BmK IA對(duì)單核細(xì)胞活化作用較靜脈注射起效快、活化率幅度高。 結(jié)論：1.有效濃度BmK IA，

10、對(duì)小鼠外周血5種免疫細(xì)胞均具有一定的活化作用，且具有一定時(shí)效性，作用強(qiáng)弱不同，以CD8<'+>T細(xì)胞為最強(qiáng)，其次為NK細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞，CD4<'+>T細(xì)胞最弱，活化高峰在用藥后8小時(shí)。2.腹腔注射，BmK IA對(duì)小鼠體內(nèi)主要免疫細(xì)胞同樣具有免疫活化作用；用藥方式不同對(duì)單核細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化作用影響較大，靜脈用藥時(shí)NK細(xì)胞活化時(shí)相早、峰值高，腹腔用藥時(shí)單核細(xì)胞活化早、峰值高，而對(duì)T細(xì)胞和B細(xì)胞活化作用影響不明顯，但腹腔用藥時(shí)峰值