異氟醚中樞作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、全麻藥的臨床應(yīng)用已有百余年歷史，但其作用機(jī)制至今仍不清楚，一直是麻醉學(xué)和神經(jīng)科學(xué)工作者長(zhǎng)期以來(lái)孜孜不倦思考和探索的問(wèn)題。在其研究史中，隨著技術(shù)方法的不斷發(fā)展，曾相繼提出過(guò)多種假說(shuō)，如脂質(zhì)學(xué)說(shuō)、突觸學(xué)說(shuō)、蛋白質(zhì)學(xué)說(shuō)、離子通道學(xué)說(shuō)等，但這些學(xué)說(shuō)因其自身的不完善或矛盾，多數(shù)已被摒棄。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性，迄今我們可能只窺見(jiàn)了全麻原理的冰山一角。 全麻藥最終需到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮麻醉作用，引起意識(shí)、痛覺(jué)、學(xué)習(xí)記憶及運(yùn)動(dòng)反射

2、的缺失等。但全麻藥特別是吸入性麻醉藥如何起效，中樞作用靶點(diǎn)位于何處，麻醉的的各種效應(yīng)與哪些腦區(qū)相關(guān)等，都是我們迫切想了解的問(wèn)題。因此，從整體水平研究麻醉劑與中樞環(huán)路的關(guān)系，找到與麻醉效應(yīng)密切相關(guān)的中樞靶位，將會(huì)大大促進(jìn)對(duì)全麻機(jī)制之迷的揭示。近年來(lái)，由于對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制了解的深入及其與全麻機(jī)制的密切相關(guān)性，從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子角度研究全麻機(jī)理已成為該領(lǐng)域中一個(gè)新的、值得重視的方向。 蛋白絲/蘇氨酸激酶(proteinserine/t

3、hreoninekinase，PSK)是機(jī)體中分布十分廣泛的蛋白激酶，種類(lèi)繁多，與眾多細(xì)胞機(jī)制的調(diào)節(jié)有關(guān)。其中神經(jīng)元中的Ca2+/磷脂依賴的蛋白激酶C(PKC)、Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)和絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK/ERK)的磷酸化水平發(fā)生變化，可反映神經(jīng)元的功能活動(dòng)。 因此，本研究首先通過(guò)麻醉行為學(xué)觀察，了解全麻藥異氟醚是否可通過(guò)不同途徑給藥起效，初步觀察麻醉劑吸入途徑與效應(yīng)的關(guān)系；繼而運(yùn)用免疫組織

4、化學(xué)和蛋白免疫印跡檢測(cè)方法，觀察異氟醚吸入給藥時(shí)腦內(nèi)PKC、CaMKⅡ、ERK1/2磷酸化水平的變化，以篩選與麻醉藥中樞作用可能相關(guān)的信號(hào)分子和腦區(qū)，為探索全身麻醉的中樞機(jī)制提供新的證據(jù)。方法和結(jié)果： 1.異氟醚靜脈注射、腹腔注射和腦室注射的麻醉效應(yīng)觀察雄性成年SD大鼠，分為側(cè)腦室給藥組、尾靜脈給藥組和腹腔給藥組。異氟醚側(cè)腦室給藥組：側(cè)腦室埋管后，于清醒狀態(tài)下緩慢注入異氟醚原液，劑量為5-25μl。尾靜脈給藥組：劑量為3-11m

5、l。腹腔給藥組：劑量為1-4ml/kg。觀察給藥后大鼠翻正反射和夾尾反射的消失和恢復(fù)時(shí)間，并在給藥后出現(xiàn)穩(wěn)定的全麻狀態(tài)后監(jiān)控大鼠的呼吸頻率、心率和平均動(dòng)脈壓等生理指標(biāo)。部分動(dòng)物在麻醉過(guò)程中抽血行血?dú)夥治觥?結(jié)果顯示，側(cè)腦室給藥組及尾靜脈給藥組的各劑量給藥后大鼠均未出現(xiàn)麻醉狀態(tài)，大鼠活動(dòng)度良好，翻正反射和夾尾反射存在。腹腔給藥后大鼠呈現(xiàn)劑量依賴性的麻醉效應(yīng)。其中注射劑量為3ml/kg時(shí)，夾尾反射消失率達(dá)100％，翻正反射消失長(zhǎng)達(dá)1

6、02.07±9.89min，夾尾反射消失達(dá)57.52±6.16min，麻醉狀態(tài)良好，各項(xiàng)生理指標(biāo)穩(wěn)定，維持時(shí)間較長(zhǎng)，適于進(jìn)行其它手術(shù)操作。 2.異氟醚吸入麻醉后腦內(nèi)ERK1/2磷酸化水平的變化及阻斷ERK1/2通路后對(duì)大鼠麻醉效應(yīng)的影響①雄性BALB/c小鼠，分為3組：正常對(duì)照組、異氟醚麻醉1h組、異氟醚麻醉1h后清醒1h組。分別取前額皮質(zhì)、海馬和腦干組織，作免疫蛋白印跡分析。 ②雄性SD大鼠和雄性BALB/c小鼠，均分

7、為對(duì)照組和阻斷組。大鼠于實(shí)驗(yàn)前1周在異氟醚吸入麻醉下做側(cè)腦室預(yù)埋管。實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠阻斷組和對(duì)照組動(dòng)物側(cè)腦室內(nèi)分別注入PD98059稀釋液6-12μl(2-4μg)或等容積DMSO溶液。BALB/c小鼠的阻斷組與對(duì)照組腹腔內(nèi)分別注射SL327稀釋液1ml(1mg)和DMSO溶液1ml。30min后將動(dòng)物吸入麻醉，觀察動(dòng)物翻正反射消失的時(shí)間。待動(dòng)物翻正反射消失5min后，終止麻醉，觀察動(dòng)物麻醉終止后翻正反射恢復(fù)的時(shí)間。然后在麻醉狀態(tài)下處死動(dòng)物，

8、用免疫組織化學(xué)ABC法觀察腦內(nèi)pERK1/2表達(dá)的變化。 Westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異氟醚吸入麻醉后小鼠皮層、海馬和腦干的pERK1/2水平均較正常對(duì)照組下降。而在麻醉清醒1h后，pERK1/2水平回復(fù)到對(duì)照組(即麻醉前)水平。 ABC法的結(jié)果顯示，麻醉后腦內(nèi)多數(shù)腦區(qū)的pERK1/2磷酸化水平下降，但終紋床核卵圓核、杏仁中央核、下丘腦室旁核等處的pERK1/2磷酸化明顯上升；給予MEK抑制劑后，這些核團(tuán)內(nèi)pERK1

9、/2磷酸化水平的上升被部分抑制。與對(duì)照組比較，給予抑制劑后，異氟醚麻醉時(shí)翻正反射消失的潛伏期和維持期均無(wú)顯著差異。 3.異氟醚吸入麻醉對(duì)腦內(nèi)CaMKⅡ磷酸化水平的影響雄性BALB/c小鼠，分為3組：正常對(duì)照組、異氟醚麻醉1h組、異氟醚麻醉1h后清醒1h組。用免疫組織化學(xué)法和Westernblot技術(shù)觀察腦內(nèi)pCaMKⅡ表達(dá)的變化。并取部分切片作pCaMKⅡ與GAD67熒光雙標(biāo)。 結(jié)果顯示異氟醚麻醉引起絕大部分腦區(qū)和核團(tuán)內(nèi)

10、pCaMKⅡ水平的可逆性降低。在對(duì)照組、麻醉組及清醒組，除在海馬和皮層中有少量pCaMKⅡ和GAD67雙標(biāo)神經(jīng)元外，其余腦區(qū)/核團(tuán)均未見(jiàn)雙標(biāo)細(xì)胞。 4.異氟醚吸入麻醉對(duì)腦內(nèi)PKC磷酸化水平的影響雄性BALB/c小鼠，分為正常對(duì)照組、異氟醚麻醉1h組、異氟醚麻醉1h后清醒1h組。分別取前額皮質(zhì)、海馬和腦干組織，制樣，作免疫蛋白印跡分析。 對(duì)照組動(dòng)物的皮層和海馬存在pPKC磷酸化表達(dá)，而在腦干未檢測(cè)到。在麻醉狀態(tài)下皮層和海馬

11、的pPKC水平可逆性地升高，麻醉清醒后恢復(fù)到對(duì)照組(即麻醉前)水平。 結(jié)論：1.側(cè)腦室、尾靜脈直接注射異氟醚原藥不能產(chǎn)生麻醉效應(yīng)，可能是因?yàn)楫惙言幨侵苄缘?，難溶于水性溶液的原因。 2.異氟醚腹腔注射可產(chǎn)生劑量依賴性全身麻醉效應(yīng)，提示腹膜具有良好的吸收脂溶性物質(zhì)的能力。當(dāng)注射劑量為3ml/kg時(shí)可產(chǎn)生理想的麻醉狀態(tài)。此結(jié)果為用異氟醚類(lèi)脂溶性藥物進(jìn)行麻醉提供了新的給藥途徑，且腹腔給藥途徑無(wú)環(huán)境污染。 3.在異氟

12、醚吸入麻醉狀態(tài)下：腦內(nèi)pCaMKⅡ處于抑制狀態(tài)；而PKC被活化；ERK在大部分腦區(qū)被抑制，而在部分核團(tuán)被激活。此結(jié)果提示，全身麻醉涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子網(wǎng)絡(luò)是錯(cuò)綜復(fù)雜的。由于這幾種分子磷酸化水平的變化均是可逆的，其變化時(shí)程與吸入麻醉的麻醉—蘇醒狀態(tài)時(shí)程相應(yīng)，因而這些分子可能參與異氟醚麻醉的中樞效應(yīng)機(jī)制，可能與麻醉效應(yīng)的產(chǎn)生和維持機(jī)制相關(guān)。 4.單一阻斷腦內(nèi)的ERK1/2通路不能明顯改變異氟醚的麻醉效應(yīng)，提示單一的信號(hào)通路在全麻機(jī)制中