未成熟新生大鼠HI后腦組織VEGF表達(dá)和血管新生的研究.pdf

1、[目的] 探討未成熟新生大鼠HIBD模型中腦組織VEGF表達(dá)和新生血管形成的情況，探討丹參對(duì)此模型VEGF表達(dá)和新生血管形成的影響。 [材料與方法] 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 64只體重7～10g新生3日齡(postnatalday3，P3)SD大鼠(早產(chǎn)組，P3)，64只體重12～20g新生7日齡SD大鼠(足月組，P7)，各組又隨機(jī)分為丹參治療組(24只)、HIBD對(duì)照組(24只)和假手術(shù)組(16只)，雌雄不

2、限。 2.動(dòng)物模型的建立及用藥 P3新生大鼠經(jīng)結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈及吸入6％濃度的氧2h制作早產(chǎn)HIBD模型；P7新生大鼠經(jīng)結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈及吸入8％濃度的氧2h制作足月HIBD模型；假手術(shù)組僅游離左側(cè)頸總動(dòng)脈而不結(jié)扎不缺氧。 丹參組術(shù)前24h及HI后即刻腹腔注射丹參注射液(早產(chǎn)0.06ml，足月0.1ml)，HI后每2h再注射丹參(早產(chǎn)0.04ml，足月0.06ml)一次，連續(xù)3次。對(duì)照組大鼠在同時(shí)間注射等量生理鹽

3、水。 3.腦形態(tài)組織學(xué)檢查 術(shù)后1d、3d、7d時(shí)各組分別處死4只大鼠，腦組織于10％中性甲醛固定。觀察缺氧缺血前后動(dòng)物行為改變及腦形態(tài)學(xué)改變。 4.免疫組織化學(xué)染色和量化 腦組織石蠟切片行免疫組織化學(xué)染色，以VEGF小鼠抗大鼠IgG單克隆抗體標(biāo)記VEGF，采用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)分析VEGF陽(yáng)性單位表達(dá)的灰度值；以CD31兔抗大鼠IgG多克隆抗體標(biāo)記微血管，高倍鏡下計(jì)數(shù)熱點(diǎn)區(qū)微血管數(shù)。 5.RT-

4、PCR 丹參組和對(duì)照組于術(shù)后1d、3d、7d時(shí)各處死4只大鼠，取缺氧缺血側(cè)腦組織提取RNA，RT-PCR檢測(cè)VEGF，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)單位，并和正常值(假手術(shù)組)比較。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。各組數(shù)據(jù)采用析因分析，同一天組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，p＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果] 1.新生大鼠HIBD模型的表現(xiàn)和病理改變 所有HIBD模

5、型組大鼠均有躁動(dòng)、發(fā)紺、嗜睡、易激惹等表現(xiàn)，復(fù)氧后足月組出現(xiàn)平衡異常及左旋現(xiàn)象，爬行時(shí)右后肢呈拖步，睜眼后左眼眼裂比右眼眼裂??；早產(chǎn)組也有平衡異常，但其他表現(xiàn)少見。形態(tài)學(xué)檢查見左大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞水腫、變性、壞死、核固縮，膠質(zhì)細(xì)胞增生；早產(chǎn)組還可見白質(zhì)水腫，結(jié)構(gòu)疏松；丹參治療組水腫變性等改變均較對(duì)照組輕。 2.腦組織VEGF免疫組化染色結(jié)果 正常新生大鼠和HIBD模型組大鼠在神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、軟腦膜細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等均可見

6、VEGF表達(dá)。各處理組之間總的VEGF表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=21.170，p=0.000)，治療組表達(dá)＞對(duì)照組＞假手術(shù)組；早產(chǎn)或足月組各處理之間總的VEGF表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=4.871，p=0.009)，治療組表達(dá)＞對(duì)照組＞假手術(shù)組。P3對(duì)照組皮質(zhì)VEGF表達(dá)HI后第1d、3d和假手術(shù)組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(17.40±3.64vs.13.13±1.33，p＜0.01：13.81±1.38vs.10.51±1.53，p＜0.05)，治療

7、組HI后第3d、7d和對(duì)照組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(23.77±1.46vs.13.81±1.38，22.12±1.01vs.14.30±3.10，p＜0.01)。P7對(duì)照組皮質(zhì)VEGF表達(dá)HI后第1d、3d和假手術(shù)組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(17.39±2.56vs.11.27±1.01，p＜0.01；16.00±1.61vs.11.42±1.99，p＜0.01)，治療組均值大于對(duì)照組，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。白質(zhì)各組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.

8、腦組織新生血管的形成 P3、P7假手術(shù)組皮質(zhì)見少量新生血管，模型組見新生血管增多。早產(chǎn)和足月組之間總的新生血管數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.884，p=0.017)，早產(chǎn)組新生血管數(shù)＞足月組；各處理組之間總的新生血管數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=68.820，p=0.000)，治療組新生血管數(shù)＞對(duì)照組＞假手術(shù)組；不同時(shí)間之間點(diǎn)總的新生血管數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=38.965，p=0.000)，7d＞3d＞1d。P3對(duì)照組皮質(zhì)新生血管數(shù)H

9、I后第1d、3d和假手術(shù)組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2.55±0.16vs.1.55±0.31，p＜0.05：5.33±0.85vs.2.67±0.27，p＜0.01)，治療組HI后第1d、3d、7d新生血管數(shù)均比假手術(shù)組多，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.55±0.87vs.1.55±0.31，5.67±0.98vs.2.67±0.27，7.00±0.78vs.4.56±0.57，p＜0.01)，且第1d、7d和對(duì)照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.55±0

10、.87vs.2.55±0.16，7.00±0.78vs.5.00±0.72，p＜0.01)。P7對(duì)照組皮質(zhì)新生血管數(shù)HI后第3d、7d和假手術(shù)組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.25±0.99vs.1.78±0.57，5.50±0.43vs.2.83±0.58，p＜0.01)，治療組1d、3d、7d新生血管數(shù)均比假手術(shù)組多，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.89±0.96vs.1.11±0.16，4.86±0.25vs.1.78±0.57，6.25±0.32v

11、s.2.83±0.58，p＜0.01)，且第1d和對(duì)照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.89±0.96vs.1.89±0.57，p＜0.01)。P3對(duì)照組白質(zhì)新生血管數(shù)HI后第7d和假手術(shù)組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.33±0.27vs.0.89±0.35，p＜0.05)，治療組HI后第3d、7d和假手術(shù)組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.22±0.17vs.0.56±0.16，1.44±0.42vs.0.89±0.35，p＜0.01)。白質(zhì)P7各組間差別

12、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.腦組織VEGFmRNA的表達(dá) 假手術(shù)組有少量VEGFmRNA表達(dá)。早產(chǎn)和足月組之間總的VEGFmRNA的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=7.433，p=0.009)，早產(chǎn)組高于足月組；各處理組之間總的VEGFmRNA的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=20.928，p=0.000)，治療組＞對(duì)照組＞假手術(shù)組；各時(shí)間點(diǎn)之間總的VEGFmRNA的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=7.796，p=0.001)，3d＞1d＞7d。P3對(duì)照組第

13、3dVEGFmRNA表達(dá)和假手術(shù)組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.76±0.17vs.0.37±0.18，p＜0.01)，治療組第1d、3d和假手術(shù)組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.89±0.23，1.14±0.18vs.0.37±0.18，p＜0.01)，且和對(duì)照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.89±0.23vs.0.60±0.17，p＜0.05；1.14±0.18vs.0.76±0.17，p＜0.01)。P7對(duì)照組和治療組各時(shí)間點(diǎn)VEGFmRNA表達(dá)都較

14、假手術(shù)組多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；治療組第1d、3d和對(duì)照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.81±0.09vs.0.51±0.11，0.88±0.25vs.0.56±0.13，p＜0.05)。 [結(jié)論] 1.對(duì)新生3天大鼠作單側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)結(jié)扎加低氧(6％O2+94％N2)2h的處理能制備非致死性的早產(chǎn)大鼠HIBD模型； 2.早產(chǎn)和足月新生大鼠HIBD模型中均有VEGF蛋白、VEGFmRNA表達(dá)的上調(diào)和新生血管形成的增多