去極化時(shí)GSK-3β活性調(diào)控新機(jī)制.pdf

1、體外培養(yǎng)在含高濃度KCI([KCI]o=25 mM,25 K)培養(yǎng)基的小腦顆粒神經(jīng)元(cerebellar granule neurons,CGNs)很好模擬了在小腦發(fā)育過(guò)程CGNs發(fā)生去極化并遷移分化成熟的現(xiàn)象。高濃度KCI(25 K)模擬了體內(nèi)的“電活性”,使CGN處于去極化狀態(tài),從而維持CGNs存活并促使其分化成熟。我們發(fā)現(xiàn)去極化(25K)時(shí)糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)

2、活性被抑制并介導(dǎo)了神經(jīng)元存活,但具體機(jī)制仍不清楚。這里,我們的研究發(fā)現(xiàn)GSK-3β活性的抑制能被L-型鈣通道拮抗劑nifedipine及calmodulin(CaM)抑制劑W-13恢復(fù),表明去極化時(shí)Ca2+/CaM介導(dǎo)了GSK-3β活性的抑制。我們通過(guò)抑制劑實(shí)驗(yàn)及體外激酶反應(yīng)證實(shí)Ca2+/CaM激活下游激酶CaMKⅡ,CaMKⅡ磷酸化GSK-3β關(guān)鍵的抑制性磷酸化位點(diǎn)Ser9。但CaMKⅡ抑制劑CaMKⅡNtide抑制GSK-3βSer

3、9的磷酸化后并不能完全恢復(fù)GSK-3β活性；進(jìn)一步,我們的雙向電泳及免疫耗竭實(shí)驗(yàn)表明去極化時(shí)有一部分(約65％)GSK-3β并不受Ser9磷酸化調(diào)控,以上結(jié)果提示其它方式參與了去極化對(duì)GSK-3β活性的調(diào)控。在這里,我們發(fā)現(xiàn)Ca2+/CaM可直接與GSK-3β相互作用,CaM—S4B pull down及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)都證實(shí)GSK-3β與CaM呈鈣依賴相互作用；通過(guò)GSK-3β續(xù)減分析,我們確定GSK-3β的60-120位氨基酸是與Ca

4、M結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域,去除這一段后GSK-3β與CaM的結(jié)合明顯減弱。此外,我們通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)分析(Bimolecular FluorescenceComplementation assay,BiFC)觀察到GSK-3β與CaM在細(xì)胞內(nèi)形成BiFC信號(hào),去除兩者相互作用區(qū)域化后BiFC信號(hào)明顯減弱,證實(shí)GSK-3β與CaM能在細(xì)胞內(nèi)相互作用。
　　 最后,激酶反應(yīng)結(jié)果表明CaM能呈濃度依賴性抑制GSK-3β活性。因此,我們的研究