氧化應(yīng)激中calpain對(duì)GSK-3β的片段化在其活性調(diào)節(jié)中的作用及機(jī)制.pdf

1、研究背景：糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是一種多功能的絲蘇氨酸蛋白激酶,其功能失調(diào)可導(dǎo)致多種疾病例如精神疾病、代謝系統(tǒng)疾病以及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展,而在此過(guò)程中,氧化應(yīng)激也發(fā)揮重要作用。多條細(xì)胞信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)GSK-3β的活性,酪氨酸216位點(diǎn)的磷酸化可以增加GSK-3β的活性,而其絲氨酸9位點(diǎn)的磷酸化則降低GSK-3β的活性,另外,胰島素途徑、wnt信號(hào)通路以及與GSK-3結(jié)合蛋白之間相互作用等都可調(diào)控GSK-3β的活

2、性。我們先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已報(bào)道過(guò)在氧化應(yīng)激的情況下,GSK-3β活性增高,但是氧化應(yīng)激是如何參與調(diào)節(jié)GSK-3β激酶活性的機(jī)制不明。已有研究報(bào)道,calpain對(duì)GSK-3βN端的片段化可導(dǎo)致GSK-3β的抑制結(jié)構(gòu)域喪失,并將GSK-3β切割為兩個(gè)具有激酶活性的片段,即calpain的激活可截?cái)郍SK-3β并使其活性升高。
　　目的：探討在HEK293/Tau441細(xì)胞系中,過(guò)氧化氫(H2O2)如何影響GSK-3β的活性及其潛在機(jī)制

3、,進(jìn)一步研究氧化應(yīng)激中calpain對(duì)GSK-3β的片段化在其活性調(diào)節(jié)中的作用及機(jī)制。
　　方法：細(xì)胞培養(yǎng),藥物處理后,用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力,同時(shí)測(cè)定SOD和MDA含量,評(píng)估氧化應(yīng)激模型是否成功建立,檢測(cè)GSK-3β活性,并運(yùn)用westernblot技術(shù)檢測(cè)GSK-3β不同位點(diǎn)磷酸化程度以及可能參與磷酸化的相關(guān)激酶活性形式的表達(dá);用I×71共聚焦顯微鏡檢測(cè)藥物處理后不同時(shí)間點(diǎn)熒光探針Fura-2-AM標(biāo)記的HEK293/

4、Tau441細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化,并運(yùn)用蛋白免疫印跡分析GSK-3β的片段化程度;隨后又用上述實(shí)驗(yàn)中所使用的過(guò)氧化氫濃度以及calpain的特異性抑制劑Ⅳ同時(shí)處理HEK293/Tau441細(xì)胞,探究calpain介導(dǎo)的GSK-3β特異性切割。
　　結(jié)果：(1)在過(guò)氧化氫處理的HEK293/Tau441細(xì)胞中,GSK-3β的活性與空白對(duì)照組相比增加了兩倍,然而GSK-3β的絲氨酸9位點(diǎn)的磷酸化程度也明顯升高,即非激活形式的GSK-3

5、β水平升高,同時(shí)GSK-3β的酪氨酸216位點(diǎn)的磷酸化程度未出現(xiàn)明顯改變;
　　(2)用過(guò)氧化氫處理HEK293/Tau441細(xì)胞1分鐘后,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度開始上升,3分鐘細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度達(dá)到高峰,而后免疫印跡分析結(jié)果顯示GSK-3β被切割為兩個(gè)片段;
　　(3)用過(guò)氧化氫和calpain特異性抑制劑Ⅳ同時(shí)處理HEK293/Tau441細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)GSK-3β的片段化效應(yīng)明顯受到抑制。
　　結(jié)論：過(guò)氧化氫通過(guò)增加細(xì)胞鈣離