氨上調(diào)星形膠質(zhì)細胞GSK-3β活性的信號傳導通路.pdf

1、目的：
　　我們推測在星形膠質(zhì)細胞中氨通過Cav-1/PTEN/PI3K/AKT信號通路降低GSK-3β磷酸化水平使其活性增加。本實驗主要探討:①原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞經(jīng)氨慢性處理，對其Cav-1mRNA和蛋白表達變化的影響;②CD-1小鼠腹腔注射尿素酶，腦內(nèi)Cav-1蛋白表達的變化;③原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞經(jīng)氨處理，對PTEN蛋白表達及AKT、ERK1/2、GSK-3β磷酸化水平的影響;④CD-1小鼠腹腔注射尿素酶，腦內(nèi)PTEN蛋白

2、表達變化及AKT、ERK1/2、GSK-3β磷酸化水平的變化;⑤GSK-3β抑制劑對原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞在氨誘導下TRPC1表達的影響;⑥氨誘導原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞及高血氨小鼠腦糖原含量的改變。
　　方法：
　?、僭切文z質(zhì)細胞培養(yǎng)成熟后，用RT-PCR方法檢測3mM氯化銨處理3天對Cav-1mRNA表達的影響;用蛋白免疫印跡方法，檢測1-5mM氯化銨處理3天或3mM氯化銨處理1-5天對Cav-1、PTEN蛋白表達和AKT

3、、ERK1/2、GSK-3β磷酸化水平的影響;②CD-1小鼠腹腔注射尿素酶1-5天，建立高血氨模型，用蛋白免疫印跡方法檢測Cav-1、PTEN蛋白表達和AKT、ERK1/2、GSK-3β磷酸化水平變化;③成年FVB/NTg(GFAP-GFP)14Mes/J或者B6.Cg-Tg(Thy1-YFPH)2Jrs/J轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射尿素酶3天，建立高血氨模型，流式細胞分選出星形膠質(zhì)細胞或神經(jīng)元，用RT-PCR方法檢測Cav-1mRNA表達變化

4、;④利用蛋白免疫印跡方法，檢測星形膠質(zhì)細胞Cav-1基因沉默及預加入PTEN抑制劑bpv、MEK抑制劑U0126對氨誘導細胞內(nèi)Cav-1蛋白表達及AKT、ERK1/2、GSK-3β磷酸化水平改變的影響;⑤利用蛋白免疫印跡方法，檢測GSK-3β抑制劑Li2CO3對3mM氯化銨引起原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞TRPC1表達改變的影響;⑥使用熒光檢測方法，將培養(yǎng)成熟的原代星形膠質(zhì)細胞用1-5mM氯化銨處理3天或3mM氯化銨處理1-5天，測定和分析糖原

5、含量;CD-1小鼠腹腔注射尿素酶1-5天，取腦組織測定和分析糖原含量;⑦使用GraphPad Prism5軟件進行統(tǒng)計學分析，多組資料用one-way ANOVA方法進行比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1、氨誘導星形膠質(zhì)細胞Cav-1mRNA及蛋白表達改變
　　原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞用3mM氯化銨處理3天，顯著上調(diào)Cav-1mRNA表達;用1-5mM氯化銨處理3天，或用3mM氯化銨處理1-5天

6、，結(jié)果表明3mM氯化銨作用3天顯著上調(diào)Cav-1表達。CD-1小鼠腹腔注射尿素酶1-5天，建立高血氨模型，結(jié)果表明尿素酶處理3天能夠使Cav-1表達顯著升高。
　　2、氨誘導星形膠質(zhì)細胞PTEN表達改變
　　原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞用3mM氯化銨處理3天以及CD-1小鼠腹腔注射尿素酶3天均可使PTEN表達顯著上升。
　　3、氨誘導星形膠質(zhì)細胞AKT磷酸化水平改變
　　原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞用1-5mM氯化銨處理3天，或

7、用3mM氯化銨處理1-5天，結(jié)果表明3mM氯化銨處理3天顯著降低AKT磷酸化水平。CD-1小鼠腹腔注射尿素酶1-5天，結(jié)果表明尿素酶處理3天能夠使AKT磷酸化水平顯著下降。
　　4、氨誘導星形膠質(zhì)細胞GSK-3β磷酸化水平改變
　　原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞用1-5mM氯化銨處理3天，或用3mM氯化銨處理1-5天，結(jié)果表明GSK-3β磷酸化水平在3mM氯化銨處理3天時降低最為顯著。CD-1小鼠腹腔注射尿素酶1-5天，結(jié)果表明GSK

8、-3β磷酸化水平在尿素酶處理3天時降低最為明顯。
　　5、氨誘導星形膠質(zhì)細胞ERK1/2磷酸化水平改變
　　原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞用1-5mM氯化銨處理3天，或用3mM氯化銨處理1-5天，結(jié)果表明氯化銨顯著上調(diào)ERK1/2磷酸化水平。CD-1小鼠腹腔注射尿素酶1-5天，建立高血氨模型，結(jié)果表明尿素酶處理3天時ERK1/2磷酸化水平顯著升高。
　　6、Cav-1基因沉默、PTEN抑制劑和MEK抑制劑對氨引起星形膠質(zhì)細胞中信

9、號通路蛋白表達改變的影響
　　Cav-1基因沉默能夠顯著抑制氨誘導的AKT、GSK-3β磷酸化水平的降低和ERK1/2磷酸化水平的升高。
　　將培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細胞經(jīng)3mM氯化銨慢性處理3天，在加入氯化銨前用PTEN抑制劑bpv預處理細胞，結(jié)果表明，氨引起的AKT、GSK-3β磷酸化水平的降低可被bpv抑制，bpv同時還可以促進ERK1/2磷酸化。
　　MEK抑制劑U0126可抑制氨引起的GSK-3β磷酸化水平的降低

10、。
　　7、氨誘導星形膠質(zhì)細胞TRPC1表達改變
　　將培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細胞經(jīng)3mM氯化銨慢性處理3天，在加入氯化銨前用GSK-3β抑制劑Li+預處理細胞，結(jié)果表明氨引起TRPC1表達的升高可被Li+抑制。
　　8、氨對星形膠質(zhì)細胞及鼠腦中糖原含量的影響
　　星形膠質(zhì)細胞分別用1-5mM氯化銨處理3天或用3mM氯化銨分別處理1-5天，結(jié)果顯示氯化銨能引起糖原含量顯著下降。小鼠腹腔注射尿素酶(33units/kg

11、/day)1-5天，結(jié)果表明尿素酶作用第3天和第4天時糖原含量明顯下降。將培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細胞經(jīng)3mM氯化銨慢性處理3天，在加入氯化銨前用PTEN抑制劑bpv預處理細胞，實驗結(jié)果表明氨引起的糖原水平降低可被bpv抑制。
　　討論：
　　本實驗明確了氨對糖原代謝過程中的干擾環(huán)節(jié)。實驗結(jié)果顯示氨慢性作用于星形膠質(zhì)細胞時，首先引起Cav-1表達上調(diào)，導致細胞膜PTEN含量的增加，抑制了PI3K激活，失活的PI3K也抑制了AKT的

12、活化，進而降低GSK-3β的磷酸化水平，使其活性增強，負性影響了GS的活性最終引起糖原含量下降，GSK-3β活性也同時影響了TRPC1的表達。糖原合成和糖原分解處于動態(tài)相互轉(zhuǎn)化。當葡萄糖充足時，體內(nèi)糖原合成加強，糖原分解減弱。尿素酶對CD-1小鼠腦組織糖原含量作用時間曲線可見對照組小鼠糖原含量每天變化無明顯差異，是因為小鼠24小時內(nèi)自由飲食，保證了葡萄糖的供給。當葡萄糖不足時，體內(nèi)糖原分解加強，糖原合成減弱。氯化銨對原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞

13、糖原含量作用時間曲線中，對照組細胞糖原含量隨著時間逐漸下降，其原因可能與細胞培養(yǎng)液中的葡萄糖隨著時間增加持續(xù)消耗，引起糖原分解有關。
　　在本研究中，慢性高血氨癥可以通過增加Cav-1和PTEN的表達抑制PI3K/AKT信號通路最終使GSK-3β活性增強。因此GSK-3β活性增強對高血氨癥的發(fā)生具有重要意義。我們之前報道過哇巴因抑制劑坎利酮不僅可以抑制氨誘導的細胞水腫及活性氧(ROS)的產(chǎn)生，而且也能抑制氨誘導的星形膠質(zhì)細胞Ca2