氨上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞GSK-3β活性的信號(hào)傳導(dǎo)通路.pdf

1、目的：
　　我們推測(cè)在星形膠質(zhì)細(xì)胞中氨通過(guò)Cav-1/PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路降低GSK-3β磷酸化水平使其活性增加。本實(shí)驗(yàn)主要探討:①原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)氨慢性處理，對(duì)其Cav-1mRNA和蛋白表達(dá)變化的影響;②CD-1小鼠腹腔注射尿素酶，腦內(nèi)Cav-1蛋白表達(dá)的變化;③原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)氨處理，對(duì)PTEN蛋白表達(dá)及AKT、ERK1/2、GSK-3β磷酸化水平的影響;④CD-1小鼠腹腔注射尿素酶，腦內(nèi)PTEN蛋白

2、表達(dá)變化及AKT、ERK1/2、GSK-3β磷酸化水平的變化;⑤GSK-3β抑制劑對(duì)原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞在氨誘導(dǎo)下TRPC1表達(dá)的影響;⑥氨誘導(dǎo)原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞及高血氨小鼠腦糖原含量的改變。
　　方法：
　　①原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)成熟后，用RT-PCR方法檢測(cè)3mM氯化銨處理3天對(duì)Cav-1mRNA表達(dá)的影響;用蛋白免疫印跡方法，檢測(cè)1-5mM氯化銨處理3天或3mM氯化銨處理1-5天對(duì)Cav-1、PTEN蛋白表達(dá)和AKT

3、、ERK1/2、GSK-3β磷酸化水平的影響;②CD-1小鼠腹腔注射尿素酶1-5天，建立高血氨模型，用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)Cav-1、PTEN蛋白表達(dá)和AKT、ERK1/2、GSK-3β磷酸化水平變化;③成年FVB/NTg(GFAP-GFP)14Mes/J或者B6.Cg-Tg(Thy1-YFPH)2Jrs/J轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射尿素酶3天，建立高血氨模型，流式細(xì)胞分選出星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元，用RT-PCR方法檢測(cè)Cav-1mRNA表達(dá)變化

4、;④利用蛋白免疫印跡方法，檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞Cav-1基因沉默及預(yù)加入PTEN抑制劑bpv、MEK抑制劑U0126對(duì)氨誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Cav-1蛋白表達(dá)及AKT、ERK1/2、GSK-3β磷酸化水平改變的影響;⑤利用蛋白免疫印跡方法，檢測(cè)GSK-3β抑制劑Li2CO3對(duì)3mM氯化銨引起原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPC1表達(dá)改變的影響;⑥使用熒光檢測(cè)方法，將培養(yǎng)成熟的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞用1-5mM氯化銨處理3天或3mM氯化銨處理1-5天，測(cè)定和分析糖原

5、含量;CD-1小鼠腹腔注射尿素酶1-5天，取腦組織測(cè)定和分析糖原含量;⑦使用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組資料用one-way ANOVA方法進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、氨誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞Cav-1mRNA及蛋白表達(dá)改變
　　原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞用3mM氯化銨處理3天，顯著上調(diào)Cav-1mRNA表達(dá);用1-5mM氯化銨處理3天，或用3mM氯化銨處理1-5天

6、，結(jié)果表明3mM氯化銨作用3天顯著上調(diào)Cav-1表達(dá)。CD-1小鼠腹腔注射尿素酶1-5天，建立高血氨模型，結(jié)果表明尿素酶處理3天能夠使Cav-1表達(dá)顯著升高。
　　2、氨誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞PTEN表達(dá)改變
　　原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞用3mM氯化銨處理3天以及CD-1小鼠腹腔注射尿素酶3天均可使PTEN表達(dá)顯著上升。
　　3、氨誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞AKT磷酸化水平改變
　　原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞用1-5mM氯化銨處理3天，或

7、用3mM氯化銨處理1-5天，結(jié)果表明3mM氯化銨處理3天顯著降低AKT磷酸化水平。CD-1小鼠腹腔注射尿素酶1-5天，結(jié)果表明尿素酶處理3天能夠使AKT磷酸化水平顯著下降。
　　4、氨誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞GSK-3β磷酸化水平改變
　　原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞用1-5mM氯化銨處理3天，或用3mM氯化銨處理1-5天，結(jié)果表明GSK-3β磷酸化水平在3mM氯化銨處理3天時(shí)降低最為顯著。CD-1小鼠腹腔注射尿素酶1-5天，結(jié)果表明GSK

8、-3β磷酸化水平在尿素酶處理3天時(shí)降低最為明顯。
　　5、氨誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平改變
　　原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞用1-5mM氯化銨處理3天，或用3mM氯化銨處理1-5天，結(jié)果表明氯化銨顯著上調(diào)ERK1/2磷酸化水平。CD-1小鼠腹腔注射尿素酶1-5天，建立高血氨模型，結(jié)果表明尿素酶處理3天時(shí)ERK1/2磷酸化水平顯著升高。
　　6、Cav-1基因沉默、PTEN抑制劑和MEK抑制劑對(duì)氨引起星形膠質(zhì)細(xì)胞中信

9、號(hào)通路蛋白表達(dá)改變的影響
　　Cav-1基因沉默能夠顯著抑制氨誘導(dǎo)的AKT、GSK-3β磷酸化水平的降低和ERK1/2磷酸化水平的升高。
　　將培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)3mM氯化銨慢性處理3天，在加入氯化銨前用PTEN抑制劑bpv預(yù)處理細(xì)胞，結(jié)果表明，氨引起的AKT、GSK-3β磷酸化水平的降低可被bpv抑制，bpv同時(shí)還可以促進(jìn)ERK1/2磷酸化。
　　MEK抑制劑U0126可抑制氨引起的GSK-3β磷酸化水平的降低

10、。
　　7、氨誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPC1表達(dá)改變
　　將培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)3mM氯化銨慢性處理3天，在加入氯化銨前用GSK-3β抑制劑Li+預(yù)處理細(xì)胞，結(jié)果表明氨引起TRPC1表達(dá)的升高可被Li+抑制。
　　8、氨對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞及鼠腦中糖原含量的影響
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞分別用1-5mM氯化銨處理3天或用3mM氯化銨分別處理1-5天，結(jié)果顯示氯化銨能引起糖原含量顯著下降。小鼠腹腔注射尿素酶(33units/kg

11、/day)1-5天，結(jié)果表明尿素酶作用第3天和第4天時(shí)糖原含量明顯下降。將培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)3mM氯化銨慢性處理3天，在加入氯化銨前用PTEN抑制劑bpv預(yù)處理細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明氨引起的糖原水平降低可被bpv抑制。
　　討論：
　　本實(shí)驗(yàn)明確了氨對(duì)糖原代謝過(guò)程中的干擾環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示氨慢性作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，首先引起Cav-1表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞膜PTEN含量的增加，抑制了PI3K激活，失活的PI3K也抑制了AKT的

12、活化，進(jìn)而降低GSK-3β的磷酸化水平，使其活性增強(qiáng)，負(fù)性影響了GS的活性最終引起糖原含量下降，GSK-3β活性也同時(shí)影響了TRPC1的表達(dá)。糖原合成和糖原分解處于動(dòng)態(tài)相互轉(zhuǎn)化。當(dāng)葡萄糖充足時(shí)，體內(nèi)糖原合成加強(qiáng)，糖原分解減弱。尿素酶對(duì)CD-1小鼠腦組織糖原含量作用時(shí)間曲線可見(jiàn)對(duì)照組小鼠糖原含量每天變化無(wú)明顯差異，是因?yàn)樾∈?4小時(shí)內(nèi)自由飲食，保證了葡萄糖的供給。當(dāng)葡萄糖不足時(shí)，體內(nèi)糖原分解加強(qiáng)，糖原合成減弱。氯化銨對(duì)原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞

13、糖原含量作用時(shí)間曲線中，對(duì)照組細(xì)胞糖原含量隨著時(shí)間逐漸下降，其原因可能與細(xì)胞培養(yǎng)液中的葡萄糖隨著時(shí)間增加持續(xù)消耗，引起糖原分解有關(guān)。
　　在本研究中，慢性高血氨癥可以通過(guò)增加Cav-1和PTEN的表達(dá)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路最終使GSK-3β活性增強(qiáng)。因此GSK-3β活性增強(qiáng)對(duì)高血氨癥的發(fā)生具有重要意義。我們之前報(bào)道過(guò)哇巴因抑制劑坎利酮不僅可以抑制氨誘導(dǎo)的細(xì)胞水腫及活性氧(ROS)的產(chǎn)生，而且也能抑制氨誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞Ca2