APOBEC-3F和-3G與乙肝核心抗原的相互作用及其在細(xì)胞中定位研究.pdf

1、研究目的和意義：
　　載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic-polypeptide,APOBEC)家族,是近年來發(fā)現(xiàn)的具有抗病毒作用的天然免疫分子,可通過DNA編輯、RNA編輯以及非編輯途徑對HIV和HBV等多種病毒進(jìn)行抑制。其中A3F和A3G可通過多種途徑抑制HBV的復(fù)制,其通過與HBcAg的相互作用,抑制HBV前體RNA的包裝,通過非編輯

2、途徑發(fā)揮病毒抑制功能;亦可通過編輯途徑對HBV基因組超突變。但目前尚有一些機(jī)制仍不明確,A3F和A3G與HBcAg的相互作用是直接的蛋白結(jié)合還是經(jīng)細(xì)胞內(nèi)其它蛋白介導(dǎo)結(jié)合;A3F和A3G的亞細(xì)胞定位與其不同途徑抑制病毒復(fù)制的功能之間的聯(lián)系等。為此,本研究通過對A3F和A3G進(jìn)行克隆、表達(dá)、亞細(xì)胞定位分析以及與乙肝核心抗原相互作用進(jìn)行研究,以期揭示A3F和A3G抑制HBV的部分待解決的疑問。
　　材料和方法：
　　1.提取經(jīng)PH

3、A刺激的人外周血單個(gè)核細(xì)胞的RNA,RT-PCR克隆人A3F和A3G的cDNA,并構(gòu)建其酵母雙雜交表達(dá)載體pGADT7-3G/-3F;PCR克隆HBVayw亞型核心抗原HBcAg基因,構(gòu)建其酵母雙雜交表達(dá)載體pGBKT7-HBcAg。
　　2.排除自激活效應(yīng)后,將構(gòu)建的載體pGBKT7-HBcAg分別與pGADT7-3G和pGADT7-3F共轉(zhuǎn)化到AH109酵母菌,利用營養(yǎng)二缺平板及四缺平板培養(yǎng)、α-半乳糖苷酶活性測試,檢測HBc

4、Ag與A3F和A3G的直接相互作用。
　　3.構(gòu)建含有HBcAg、人A3F和A3G基因的多種標(biāo)簽融合真核表達(dá)載體,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀回收產(chǎn)物的Western blotting檢測。
　　4.人A3F和A3G的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞,間接免疫熒光檢測人A3F和A3G的亞細(xì)胞定位。
　　5.構(gòu)建含有核定位信號的綠色熒光蛋白表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞,觀察核定位信號的定位功能;并將人

5、A3F和A3G與上述經(jīng)功能驗(yàn)證具有核定位功能的核定位信號融合表達(dá),免疫熒光觀察人A3F和A3G是否發(fā)生轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)果及結(jié)論：
　　1.酶切及DNA測序分析表明成功克隆HBcAg、人A3F和A3G,并成功構(gòu)建酵母雙雜交、免疫共沉淀、真核表達(dá)及亞細(xì)胞定位相關(guān)的表達(dá)質(zhì)粒。
　　2.通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)對α-半乳糖苷酶定性和定量檢測顯示,A3F和A3G蛋白均與HBcAg蛋白可能不存在相互作用亦或是并不發(fā)生直接的相互作用,而是可

6、能通過某個(gè)蛋白的介導(dǎo)而發(fā)生間接相互作用。
　　3.將構(gòu)建好的pcFlag-3F、pcFlag-3G、pcMyc-HBcAg質(zhì)粒分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞48hr后通過Westernblot顯示A3F和A3G蛋白和HBcAg蛋白在HeLa細(xì)胞中均能很好表達(dá);進(jìn)一步將轉(zhuǎn)染48hr后的HeLa細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)顯示A3F/A3G蛋白和HBcAg蛋白均能被沉淀下來,而蛋白量有所下降。
　　4.在熒光顯微鏡下觀察顯示A3F和

7、A3G重組蛋白呈密集點(diǎn)狀主要分布在細(xì)胞胞漿,而胞核位置無明顯熒光信號。表明A3F和A3G蛋白主要定位于細(xì)胞胞漿。
　　5.熒光觀察顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-C1對照載體的MDCK細(xì)胞,其GFP彌散分布在細(xì)胞中,而與BNLS及MNLS融合表達(dá)的GFP主要分布于細(xì)胞核中。表明,BNLS和MNLS均顯示核定位生物學(xué)活性。
　　6.熒光觀察顯示MNLS及BNLS融合表達(dá)的A3F和A3G,仍然主要分布在細(xì)胞胞漿中。上述結(jié)果表明,可以有效引導(dǎo)