APOBEC-3F和-3G與乙肝核心抗原的相互作用及其在細胞中定位研究.pdf

1、研究目的和意義：
　　載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic-polypeptide,APOBEC)家族,是近年來發(fā)現(xiàn)的具有抗病毒作用的天然免疫分子,可通過DNA編輯、RNA編輯以及非編輯途徑對HIV和HBV等多種病毒進行抑制。其中A3F和A3G可通過多種途徑抑制HBV的復制,其通過與HBcAg的相互作用,抑制HBV前體RNA的包裝,通過非編輯

2、途徑發(fā)揮病毒抑制功能;亦可通過編輯途徑對HBV基因組超突變。但目前尚有一些機制仍不明確,A3F和A3G與HBcAg的相互作用是直接的蛋白結合還是經(jīng)細胞內(nèi)其它蛋白介導結合;A3F和A3G的亞細胞定位與其不同途徑抑制病毒復制的功能之間的聯(lián)系等。為此,本研究通過對A3F和A3G進行克隆、表達、亞細胞定位分析以及與乙肝核心抗原相互作用進行研究,以期揭示A3F和A3G抑制HBV的部分待解決的疑問。
　　材料和方法：
　　1.提取經(jīng)PH

3、A刺激的人外周血單個核細胞的RNA,RT-PCR克隆人A3F和A3G的cDNA,并構建其酵母雙雜交表達載體pGADT7-3G/-3F;PCR克隆HBVayw亞型核心抗原HBcAg基因,構建其酵母雙雜交表達載體pGBKT7-HBcAg。
　　2.排除自激活效應后,將構建的載體pGBKT7-HBcAg分別與pGADT7-3G和pGADT7-3F共轉化到AH109酵母菌,利用營養(yǎng)二缺平板及四缺平板培養(yǎng)、α-半乳糖苷酶活性測試,檢測HBc

4、Ag與A3F和A3G的直接相互作用。
　　3.構建含有HBcAg、人A3F和A3G基因的多種標簽融合真核表達載體,脂質(zhì)體法轉染HeLa細胞進行免疫共沉淀實驗和免疫共沉淀回收產(chǎn)物的Western blotting檢測。
　　4.人A3F和A3G的真核表達載體轉染MDCK細胞,間接免疫熒光檢測人A3F和A3G的亞細胞定位。
　　5.構建含有核定位信號的綠色熒光蛋白表達載體,轉染MDCK細胞,觀察核定位信號的定位功能;并將人

5、A3F和A3G與上述經(jīng)功能驗證具有核定位功能的核定位信號融合表達,免疫熒光觀察人A3F和A3G是否發(fā)生轉位。
　　結果及結論：
　　1.酶切及DNA測序分析表明成功克隆HBcAg、人A3F和A3G,并成功構建酵母雙雜交、免疫共沉淀、真核表達及亞細胞定位相關的表達質(zhì)粒。
　　2.通過酵母雙雜交實驗對α-半乳糖苷酶定性和定量檢測顯示,A3F和A3G蛋白均與HBcAg蛋白可能不存在相互作用亦或是并不發(fā)生直接的相互作用,而是可

6、能通過某個蛋白的介導而發(fā)生間接相互作用。
　　3.將構建好的pcFlag-3F、pcFlag-3G、pcMyc-HBcAg質(zhì)粒分別進行轉染HeLa細胞48hr后通過Westernblot顯示A3F和A3G蛋白和HBcAg蛋白在HeLa細胞中均能很好表達;進一步將轉染48hr后的HeLa細胞裂解產(chǎn)物進行Co-IP實驗顯示A3F/A3G蛋白和HBcAg蛋白均能被沉淀下來,而蛋白量有所下降。
　　4.在熒光顯微鏡下觀察顯示A3F和

7、A3G重組蛋白呈密集點狀主要分布在細胞胞漿,而胞核位置無明顯熒光信號。表明A3F和A3G蛋白主要定位于細胞胞漿。
　　5.熒光觀察顯示轉染pEGFP-C1對照載體的MDCK細胞,其GFP彌散分布在細胞中,而與BNLS及MNLS融合表達的GFP主要分布于細胞核中。表明,BNLS和MNLS均顯示核定位生物學活性。
　　6.熒光觀察顯示MNLS及BNLS融合表達的A3F和A3G,仍然主要分布在細胞胞漿中。上述結果表明,可以有效引導