人APOBEC3G基因的克隆表達及HIV-1感染者APOBEC3G-B-F表達的研究.pdf

1、第一部分:
　　 人APOBEC3G基因的克隆與真核表達
　　 目的：建立宿主固有抗HIV-1因子載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3G(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme,catalytic polypeptide-like3G,APOBEC3G,hA3G)的真核表達體系。方法：采用反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)從HIV-1感染者外周血單個核細胞(PBMC)中獲取h

2、A3G基因編碼區(qū),將其連接入T載體,測序驗證后再克隆至真核表達載體pEGFP-N1中,然后將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-A3G轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,分別用RT-PCR法和蛋白印跡法(Western Blot)驗證融合蛋白hA3G-EGFP在mRNA和蛋白水平的表達。結(jié)果：克隆獲得hA3G基因編碼區(qū)長1154 bp,測序結(jié)果與GenBank中hA3G參考序列(NM021822)比對發(fā)現(xiàn)存在兩處差異,分別位于mRNA第588位和746位堿基

3、處。重組質(zhì)粒pEGFP-N1-A3G轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,在熒光顯微鏡下觀察到了綠色熒光,并分別用RT-PCR法和Western Blot法驗證了目的基因hA3G在rnRNA和蛋白水平的表達。結(jié)論：成功建立了人固有免疫物質(zhì)hA3G的真核表達體系,為進一步研究其在HIV-1感染中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分:
　　 HIV-1感染者PBMC中APoBEC3G/B/F基因表達水平及其與CD4計數(shù)的相關(guān)性研究
　

4、　 目的：人胞嘧啶脫氨基酶家族(hAPOBEC3,hA3)是近年來被發(fā)現(xiàn)的機體固有免疫物質(zhì),其中成員hA3G、hA3B和hA3F均在體外被證實具有抗Vif缺陷型HIV-1復(fù)制的作用,另外hA3B對野生型HIV-1亦具有抑制活性。本研究定量分析HIV-1感染者外周血單個核細胞(PBMC)中hA3G、hA3B和hA3F的mRNA表達水平,并進一步分析它們與CD4+T細胞計數(shù)的相關(guān)性,以闡明它們的表達水平與臨床疾病進展的關(guān)系。方法：收集未接

5、受和已接受抗病毒治療的HIV-1感染者(各21例)以及HIV-1陰性正常人(10例)外周靜脈血標(biāo)本,采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC,TRIzol法抽提總RNA,然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用實時熒光定量PCR的方法對hA3G、hA3B和hA3F的基因表達水平進行相對定量分析,用流式細胞儀檢測CD4+T細胞計數(shù)。結(jié)果：無論是未接受還是已接受抗病毒治療的HIV-1感染者,其hA3G、hA3B和hA3F mRNA水平與CD4+T計數(shù)均

6、不具有相關(guān)性;HIV-1感染者hA3G mRNA水平低于正常人(P＜0.05),但未治療與已治療者相比不存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);hA3B及hA3F基因表達水平在三組人群間比較均存在顯著性差異:未治療HIV-1感染者＜己治療HIV-1感染者＜正常人(P＜0.05);已治療HIV-1感染者和正常人的三種APOBEC3家族成員hA3G、hA3B和hA3F的mRNA表達水平具有正相關(guān)性,而在未治療HIV-1感染者三者無此相關(guān)性。結(jié)論：h