真核細(xì)胞翻譯起始因子亞基eIF3g的核定位及相互作用核蛋白的研究.pdf

1、真核翻譯起始因子(eukaryotic translation initiation factors，eIFs)是一類重要的細(xì)胞內(nèi)功能蛋白，形成蛋白質(zhì)翻譯起始復(fù)合物，引導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的起始。已明確的eIFs有六種(eIF1～eIF6)，每種eIF由多個(gè)亞基組成。近年來(lái)不斷有研究發(fā)現(xiàn)一些eIFs的亞基在腫瘤細(xì)胞中存在異常表達(dá)的現(xiàn)象，并且這些亞基表達(dá)的異常與腫瘤的惡性行為相關(guān)，如eIF4E在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常升高，可以作為一個(gè)有效的治療靶點(diǎn)，

2、因此eIFs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。eIF3是最大最復(fù)雜的一個(gè)真核翻譯起始因子，是蛋白質(zhì)翻譯起始復(fù)合物中與其他翻譯起始因子相互聯(lián)系的中心蛋白因子之一。目前已知eIF3由13個(gè)亞基組成，分子量約為700～800 kD，其各亞基按分子量遞減分別命名為eIF3a至eIF3m。eIF3g是eIF3的一個(gè)核心亞基，在翻譯終止后的再起始過程中起著重要作用，并且該亞基還具有與細(xì)胞骨架蛋白4.1R和凋亡誘導(dǎo)因子AIF相結(jié)合的位點(diǎn)。

3、本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)eIF3g在耐藥的白血病細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)白血病細(xì)胞中eIF3g的表達(dá)可以抑制白血病細(xì)胞的耐藥性及生長(zhǎng);在乳腺癌臨床標(biāo)本中，eIF3g的過表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移正相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)給我們進(jìn)一步研究eIF3g在腫瘤中的機(jī)制提供了依據(jù)，我們?cè)O(shè)想在腫瘤中異常表達(dá)的eIF3g蛋白有可能通過非翻譯起始相關(guān)的機(jī)制在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了一定的作用。
　　在本課題中，我們首先通過生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)了eIF3g可能具有細(xì)胞核定位，進(jìn)一

4、步用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了eIF3g的核定位，并尋找、鑒定與之相互作用的核蛋白，為今后的研究提供線索。我們通過核質(zhì)分離技術(shù)結(jié)合Western blot、細(xì)胞免疫熒光染色驗(yàn)證了eIF3g在細(xì)胞核中的存在，通過核蛋白免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析鑒定了與eIF3g在細(xì)胞核中相互作用的蛋白質(zhì)，包括不均一核糖核蛋白（hnRNPU），鋅指蛋白(HSZFP36)，和肌動(dòng)蛋白(β-actin)，并采用了正反向的免疫共沉淀、化學(xué)交聯(lián)、GST-pulldown以及激光共聚焦

5、共定位觀察等多種技術(shù)進(jìn)行了多方面驗(yàn)證。具體內(nèi)容如下:
　　1.預(yù)測(cè)并驗(yàn)證eIF3g的細(xì)胞核定位
　　通過在線生物信息學(xué)工具WoLF PSORT(http://wolfpsort.org)，PROSTⅡPrediction(http://psort.hgc.jp/form2.html), Subnuclear Compartments PredictionSystem(http://array.bioengr.uic.edu/

6、subnuclear.htm)和 PredictProtein(https://www.predictprotein.org)預(yù)測(cè)eIF3g的亞細(xì)胞定位及功能，通過核質(zhì)分離后Western blot檢測(cè)和激光共聚焦觀察驗(yàn)證eIF3g的亞細(xì)胞定位。四個(gè)生物信息學(xué)工具都預(yù)測(cè)了eIF3g具有細(xì)胞核定位，PredictProtein預(yù)測(cè)了eIF3g在細(xì)胞核中具有結(jié)合DNA和RNA等功能。細(xì)胞核蛋白的Western blot檢測(cè)和細(xì)胞免疫熒光染色

7、結(jié)合激光共聚焦觀察都驗(yàn)證了eIF3g具有細(xì)胞核定位。
　　2.鑒定與eIF3g相互作用的核蛋白
　　為了進(jìn)一步研究eIF3g在細(xì)胞核中相互作用的蛋白質(zhì)，我們構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)eIF3g的Bcap37/Tet-On-eIF3g細(xì)胞株，分離細(xì)胞核并裂解獲得核蛋白，以eIF3g抗體進(jìn)行免疫共沉淀，SDS-PAGE電泳分離后考馬斯亮藍(lán)染色，選取共沉淀的蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定。與對(duì)照相比，免疫共沉淀得到4條較明顯的蛋白條帶，質(zhì)譜分析鑒

8、定分別為真核細(xì)胞翻譯起始因子3A(eIF3A)、不均一核糖核蛋白（hnRNPU）、鋅指蛋白(HSZFP36)和肌動(dòng)蛋白(β-actin)，這些蛋白均通過Western blot和激光共聚焦觀察證實(shí)存在于核蛋白組分中。
　　3.驗(yàn)證與eIF3g相互作用的核蛋白
　　分離Bcap37/Tet-On-eIF3g細(xì)胞核，將細(xì)胞核蛋白進(jìn)行正反向免疫共沉淀，正向免疫共沉淀結(jié)果表明eIF3g抗體可沉淀出hnRNPU、HSZFP36、β-a

9、ctin，反向共沉淀結(jié)果表明hnRNPU、HSZFP36、β-actin抗體可沉淀出eIF3g。對(duì)核蛋白進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)后利用Western blot檢測(cè)，結(jié)果表明eIF3g可與hnRNP U、HSZFP36和β-actin結(jié)合成復(fù)合體。我們還構(gòu)建了質(zhì)核表達(dá)GST-eIF3g融合蛋白的載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后誘導(dǎo)表達(dá)，與Bcap37細(xì)胞核蛋白及連接磁珠的GSH相互作用后進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果表明GST-eIF3g可以下拉h(huán)nRNP

10、U、HSZFP36和β-actin。此外，對(duì)Bcap37/Tet-On-eIF3g細(xì)胞進(jìn)行eIF3g的免疫熒光染色后，利用激光共聚焦顯微鏡也觀察到eIF3g與HSZFP36和β-actin的共定位。因此，免疫共沉淀、化學(xué)交聯(lián)、GST-pulldown和激光共聚焦觀察共定位都證實(shí)了eIF3g與HSZFP36和β-actin相互作用。創(chuàng)新性結(jié)論:本研究首次發(fā)現(xiàn)并證明eIF3g可以進(jìn)入細(xì)胞核，并能與hnRNPU、HSZFP36、β-actin