羥苯磺酸鈣調(diào)控一氧化氮對(duì)ECV304細(xì)胞及糖尿病大鼠腎臟MMPs-TIMPs影響的研究.pdf

1、內(nèi)皮細(xì)胞及其細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的相互作用在維持正常組織結(jié)構(gòu)、功能及細(xì)胞生長(zhǎng)、分化過(guò)程中有著非常重要意義。ECM不再被認(rèn)為是靜止不動(dòng)的隔膜，而是處在不斷代謝更新、降解重塑的動(dòng)態(tài)平衡中。ECM成分的變化參與了多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。而基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)的平衡對(duì)ECM的構(gòu)成和病理改變有著十分重要的作用。一氧化氮(NO)是體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能重要的信號(hào)分子，而在腎臟NO有著保護(hù)和損害的雙重作用，NO對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞

2、合成MMPs/TIMPs是否有目前影響尚未見(jiàn)報(bào)道。羥苯磺酸鈣(calciumdobesilate，Cadb)是治療糖尿病微血管病變的經(jīng)典用藥并且被證實(shí)可以體外抑制糖尿病大鼠腎小球基底膜膠原合成而其機(jī)制尚不清楚。 本課題離體實(shí)驗(yàn)研究NO對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304細(xì)胞MMPs/TIMPs表達(dá)的影響和羥苯磺酸鈣調(diào)控ECV304細(xì)胞MMPs/TIMPs表達(dá)及其內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynth

3、ase、eNOS)基因表達(dá)的關(guān)系。在體實(shí)驗(yàn)觀察羥苯磺酸鈣對(duì)不同病程的STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟NO-NOS系統(tǒng)、腎小球基底膜病理改變、腎臟eNOS、MMPs/TIMPs基因和蛋白的表達(dá)的關(guān)系。旨在探討羥苯磺酸鈣調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞MMPs/TIMPs表達(dá)及其誘導(dǎo)的基底膜降解、逆轉(zhuǎn)糖尿病大鼠腎小球基底膜增厚的分子生物學(xué)機(jī)制，為糖尿病腎病的病因?qū)W提供新的認(rèn)識(shí)，亦為臨床防治糖尿病腎病提供新的理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)ECV304細(xì)胞及STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模

4、型動(dòng)態(tài)觀察如下：(1)NO前體L-精氨酸(L-Arg)與ECV304細(xì)胞MMP-2、9及TIMP-1、2表達(dá)的關(guān)系；(2)一氧化氮合酶(NOS)抑制劑L-NG-硝基-精氨酸(LNNA)對(duì)內(nèi)源性NO調(diào)控ECV304細(xì)胞MMP-2、9及TIMP-1、2表達(dá)的影響；(3)羥苯磺酸鈣對(duì)ECV304細(xì)胞NO-NOS活性的影響；(4)羥苯磺酸鈣對(duì)ECV304細(xì)胞eNOS基因表達(dá)的影響；(5)羥苯磺酸鈣對(duì)ECV304細(xì)胞MMP-2、9及TIMP-1、

5、2表達(dá)的影響；(6)NOS抑制劑對(duì)羥苯磺酸鈣誘導(dǎo)ECV304細(xì)胞MMP-2、9及TIMP-1、2基因表達(dá)的影響；(7)糖尿病大鼠腎臟NO、NOS活性及eNOSmRNA、蛋白的表達(dá)；(8)糖尿病大鼠腎臟MMP-2、9及TIMP-1、2mRNA、蛋白表達(dá)及膠原Ⅳ蛋白、腎小球基底膜病變的變化；(9)羥苯磺酸鈣對(duì)糖尿病大鼠腎臟eNOSmRNA、蛋白表達(dá)的影響；(10)羥苯磺酸鈣對(duì)糖尿病大鼠腎臟MMP-2、9及TIMP-1、2mRNA、蛋白表達(dá)及

6、膠原Ⅳ蛋白、腎小球基底膜病變的影響； 研究結(jié)果表明：(1)L-Arg可上調(diào)ECV304細(xì)胞的MMP-2mRNA/GAPDHmRNA比值，其作用呈濃度依賴(lài)性。10-5、10-4和10-3mol/L組的MMP-2mRNA/GAPDHmRNA比值(分別為1.57±0.09、2.53±0.11和2.43±0.09)較對(duì)照組(0.81±0.04)表達(dá)均顯著增強(qiáng)(P＜0.01)。L-Arg對(duì)MMP-9mRNA/GAPHD無(wú)明顯影響。

7、 (2)L-Arg以濃度依賴(lài)的方式下調(diào)ECV304細(xì)胞的的TIMP-1mRNA表達(dá)。10-5、10-4和10-3mol/LL-Arg組TIMP-1mRNA/GAPDHmRNA比值(分別為0.59±0.04、0.47±0.03和0.35±0.03)表達(dá)均較對(duì)照組(0.69±0.05)顯著降低(P＜0.01)。 (3)L-Arg以濃度依賴(lài)的方式下調(diào)ECV304細(xì)胞的的TIMP-2mRNA表達(dá)。10-5、10-4和10-3mol/LL

8、-Arg組TIMP-2mRNA/GAPDHmRNA比值(分別為0.56±0.05、0.39±0.03和0.19±0.01)均較對(duì)照組(0.92±0.07)顯著降低(P＜0.01)。 (4)10-4mmol/LNOS抑制劑LNNA可以阻斷L-Arg上調(diào)MMP-2mRNA表達(dá)及下調(diào)TIMP-1、-2mRNA表達(dá)的作用。 (5)羥苯磺酸鈣上調(diào)eNOSmRNA表達(dá)，其作用呈濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。0.25×10-3、0.5×10

9、-3和1.0×10-3mol/L組eNOSmRNA/GAPDHmRNA比值(分別為0.52±0.04、0.86±0.05和0.89±0.07)較對(duì)照組(0.30±0.02)比較，差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。隨著羥苯磺酸鈣作用時(shí)間的延長(zhǎng)，24h、36h和48h組ECV304細(xì)胞的eNOSmRNA表達(dá)均較12h組和對(duì)照組有顯著性增高(P＜0.01)。 (6)羥苯磺酸鈣可上調(diào)ECV304細(xì)胞的MMP-2mRNA表達(dá)，其作

10、用呈濃度依賴(lài)性。0.25×10-3、0.5×10-3和1.0×10-3mol/L羥苯磺酸鈣組MMP-2/GAPDHmRNA比值(分別為0.89±0.05、1.87±0.09和1.95±0.09)均較對(duì)照組(0.78±0.04)顯著增高(P＜0.01)，對(duì)MMP-9mRNA表達(dá)無(wú)顯著影響。 (7)羥苯磺酸鈣可下調(diào)ECV304細(xì)胞的TIMP-1、-2mRNA表達(dá)，其作用呈濃度依賴(lài)性。0.5×10-3和1.0×10-3mol/L羥苯磺

11、酸鈣組ECV304細(xì)胞的TIMP-1mRNA/GAPDHmRNA比值分別為0.71±0.05、0.62±0.04，均較對(duì)照組(0.96±0.07)有顯著性差異(P＜0.01)。0.25×10-3、0.5×10-3和1.0×10-3mol/L羥苯磺酸鈣組ECV304細(xì)胞的TIMP-2mRNA/GAPDHmRNA比值分別為0.61±0.04、0.39±0.03、0.23±0.02，均較對(duì)照組(0.71±0.05)有顯著性降低(P＜0.01)

12、。 (8)10-4mmol/LNOS抑制劑LNNA可阻斷羥苯磺酸鈣上調(diào)MMP-2mRNA的作用(P＜0.01)。 (9)10-4mmol/LNOS抑制劑LNNA可阻斷羥苯磺酸鈣下調(diào)TIMP-1、-2mRNA表達(dá)的作用(P＜0.05)。 (10)糖尿病大鼠模型組4周時(shí)腎臟NO含量、NOS活性較對(duì)照組顯著增加(P＜0.01)；12周時(shí)NO含量、NOS活性較對(duì)照組顯著降低(P＜0.01)。 (11)糖尿病大鼠模

13、型組4周時(shí)腎臟eNOSmRNA、蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增加(P＜0.01)，12周時(shí)eNOSmRNA、蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增加降低(P＜0.01)。 (12)糖尿病大鼠模型組4周時(shí)腎臟MMP-2、9mRNA、蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增加(P＜0.01)，12周時(shí)MMP-2、9mRNA、蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增加降低(P＜0.01)； (13)糖尿病大鼠模型組4周時(shí)腎臟膠原Ⅳ表達(dá)、基底膜厚度正常，12周腎臟膠原Ⅳ表

14、達(dá)增加、基底膜厚度增加； (14)羥苯磺酸鈣可以上調(diào)糖尿病大鼠腎臟4周、12周的NO含量、NOS活性； (15)羥苯磺酸鈣可以上調(diào)糖尿病大鼠腎臟4周、12周的eNOSmRNA、蛋白表達(dá)； (16)羥苯磺酸鈣可以上調(diào)糖尿病大鼠腎臟4周、12周的MMP-2mRNA、蛋白表達(dá)，對(duì)MMP-9mRNA、蛋白表達(dá)無(wú)影響； (17)羥苯磺酸鈣可以下調(diào)糖尿病大鼠腎臟12周的TIMP-1、-2mRNA、蛋白表達(dá)，對(duì)4周時(shí)表

15、達(dá)無(wú)影響。 (18)羥苯磺酸鈣可以減少糖尿病大鼠12周時(shí)腎臟膠原Ⅳ的表達(dá)，減輕腎小球基底膜增厚。 上述結(jié)果提示：(1)L-Arg可以呈濃度依賴(lài)方式上調(diào)MMP-2、下調(diào)TIMP-1、-2mRNA表達(dá)，表明增加內(nèi)源性NO有助于增加膠原的降解；(2)羥苯磺酸鈣具有濃度依賴(lài)方式上調(diào)ECV304細(xì)胞eNOSmRNA表達(dá)的作用；(3)羥苯磺酸鈣可以濃度依賴(lài)方式上調(diào)ECV304細(xì)胞MMP-2mRNA表達(dá)，下調(diào)TIMP-1、2mRNA表

16、達(dá)，從而促進(jìn)MMP-2、-9降解血管基底膜膠原的能力；這個(gè)調(diào)節(jié)途徑部分由eNOS合成NO所介導(dǎo)；(4)一氧化氮對(duì)糖尿病腎病有著保護(hù)和損害的雙重作用并通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9的作用參與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。(5)羥苯磺酸鈣可以通過(guò)促進(jìn)糖尿病大鼠12周腎臟NO-NOS活性、eNOS表達(dá)來(lái)增加MMP-2表達(dá)、抑制TIMP-1、2表達(dá)，從而促進(jìn)腎小球基底膜膠原Ⅳ的降解，改善糖尿病腎病晚期基底膜病變。 綜上所述，不難看出內(nèi)源性NO