內毒素休克小鼠肝臟細胞質磷酸化蛋白質組學的研究.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是感染引起的全身炎癥反應征候群，其嚴重并發(fā)癥——感染性休克(septic shock)是創(chuàng)傷、燒傷和手術后病人最主要的死亡原因之一。統計表明，臨床半數的膿毒癥是由于革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria)感染引起的，革蘭氏陰性菌的細胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，或稱為內毒素(endotoxin)，被認為是革蘭氏陰性菌引起膿毒癥的主要作用分子。LPS廣泛作用于機體

2、多種組織器官，其中內皮細胞、巨噬細胞和中性粒細胞是最主要的效應細胞，在LPS的刺激下，它們產生大量的細胞因子，即“細胞因子風暴”(cytokine storm)，進而引起失控性的炎癥級聯反應，最終引起內毒素休克、組織損傷和多器官功能障礙(mutiple organ dysfunction，MOD)。因此，膿毒癥或內毒素休克(endotoxic shock)的分子機制的研究大多集中在內皮、巨噬細胞和中性粒細胞上，而在其它組織和器官上的相對

3、研究較少。
　　肝臟是人體代謝的樞紐，也是重要的免疫器官，血液中大量蛋白也是由肝臟合成分泌的。在膿毒癥的炎性應激刺激下，肝臟可以大量合成并分泌急性期蛋白(acute phaseprotein，AP)，如C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、α1-蛋白酶抑制劑(alpha1-proteinase inhibitor)、結合珠蛋白(haptoglobin)、纖維蛋白原(fibrinogen)及補體(comple

4、ment)等，可以啟動迅速的機體防御機制。然而肝臟對病原微生物或其毒性產物產生什么樣的反應？膿毒癥或感染性休克發(fā)生發(fā)展進程中肝臟自身變化如何？肝臟通過什么樣的分子調控機制調控多種炎癥相關反應蛋白的表達？對于這些問題，目前所知有限。然而，對這些問題的解答，對于了解錯綜復雜的膿毒癥及其感染性休克的發(fā)病機制無疑是有益的。
　　LPS信號轉導通路的啟動是內毒素致病過程中的重要環(huán)節(jié)。細胞信號轉導研究的中心問題就是細胞感受、轉導環(huán)境刺激及調節(jié)

5、代謝生理反應和基因表達的分子途徑。磷酸化修飾本身所具有的簡單(simplicity)、靈活(flexibility)、可逆(reversibility)的特性以及磷酸基團的供體ATP的易得性，使得磷酸化修飾被真核細胞所選擇接受成為一種最普遍的調控手段，蛋白質磷酸化在信號轉導中所起的無可替代的作用已是人所共知的事實。蛋白質的磷酸化和去磷酸化這一可逆過程幾乎調節(jié)著包括細胞的增殖、發(fā)育、分化，信號轉導，細胞凋亡、神經活動，肌肉收縮，腫瘤發(fā)生等

6、過程在內的所有生命活動，目前已經知道有許多人類疾病是由于異常的磷酸化修飾所引起，而有些磷酸化修飾卻是某種疾病所導致的后果。那么，內毒素休克早期細胞質發(fā)生了哪些功能事件？其具體分子機制如何？目前所知甚少。因此，進行內毒素休克時肝臟細胞細胞質中大規(guī)模磷酸化蛋白質組學分析對研究內毒素休克的發(fā)生發(fā)展機制是十分重要的。
　　以往的研究大多是在已有的工作基礎上對少數幾個細胞分子進行分析、在理論上推導出對疾病發(fā)生發(fā)展可能具有重要意義的分子，進而

7、進行深入細致的功能研究。這是一種傳統的研究策略，其優(yōu)點是研究問題集中，容易深入，可以比較透徹地回答一個點上的問題，但是若將這個結果放到一個體系層面上，其功能又變得撲簌迷離，這是由“分析”主導的研究手段的局限所導致的，只有當這種“點”的結果積累得足夠多的時候，體系的問題也會變得逐漸清晰起來，但這個過程一般需要長時間的積累。而蛋白質組是高度動態(tài)的，即使同一細胞在不同生理或病理環(huán)境中，其蛋白表達也是不同的，這種差異蛋白往往是某些疾病發(fā)生的標志

8、。利用比較蛋白質組研究技術，可以批量觀察正常與疾病細胞（組織）在蛋白質表達譜上的差異，從整體水平上規(guī)?；睾Y選和發(fā)掘潛在的藥物標靶，以及適用于早期診斷、介入和治療的疾病蛋白標志物。但蛋白的功能僅僅從量的變化上分析往往會限制我們的研究視野，很多重要蛋白質的活性是由翻譯后修飾調節(jié)的，有時蛋白水平上看不到明顯變化但翻譯后修飾水平已有顯著變化。因此采用定量技術對內毒素刺激前后小鼠肝臟細胞質磷酸化蛋白質組學進行差異定量分析，尋找一批與內毒素休克肝

9、損傷的發(fā)生發(fā)展緊密相關的高特異性和靈敏性的生物標記物是非常有價值的。
　　由于蛋白質組學研究具有大規(guī)模、高通量、高靈敏度的特點，因此可以有效分析細胞內的整體蛋白質。然而整個細胞或組織的蛋白組成極其復雜，直接對其進行蛋白質組學分析，往往會丟掉很多蛋白質信息，由此衍生出了亞細胞蛋白質組學。亞細胞蛋白質組就是利用蛋白質組學研究技術來分析一種組織或細胞的某一亞細胞結構內的蛋白質組成，它一方面可以降低樣品的復雜度，使分析簡單化;另一方面可以

10、相對富集相應亞細胞結構的低豐度蛋白，并且可以部分提示蛋白質的定位和功能信息。國外已有亞細胞蛋白質組方面的研究報道，并向縱深發(fā)展，出現了亞細胞器蛋白質組和復合體蛋白質組;但目前關于內毒素休克過程中肝臟細胞質蛋白的亞細胞蛋白質組研究國內外未見報道。
　　熒光差異凝膠電泳(fluorescence differential gel electrophoresis，DIGE)是一種在2-DE電泳之前進行熒光染料標記蛋白樣品的方法，通過對不

11、同的蛋白樣品用不同的熒光染料進行標記，在同一塊雙向凝膠中可同時分離多至三種不同的蛋白樣品，并且每塊膠上又引用了內標，內標的利用進一步增加可信度，確保結果能反映出真實的生物學差異，避免了系統誤差實驗結果的影響，從而能夠對樣品間蛋白質豐度差異進行精確分析。DIGE系統最大的優(yōu)點就是整合了CyDye染料多重標記方法與DeCyde差異分析軟件的優(yōu)勢。DeCyder差異分析軟件利用了共找點檢測的算法，能對熒光圖像進行自動檢測、背景消除、定量、歸一

12、化以及凝膠內匹配，避免了人為因素的影響，消除了不同操作者帶來的系統誤差。
　　基于上述思考，我們利用LPS來制作內毒素休克BALB/c小鼠模型，采用差速離心結合蔗糖密度梯度離心提取和純化了正常組和LPS刺激1h后的小鼠肝臟細胞質蛋白并利用金屬磷酸鹽親和層析樹脂富集磷酸化蛋白后，采用DIGE技術對兩組磷酸化蛋白進行分離，并建立了相應的差異蛋白圖譜。通過DeCyder差異分析軟件分析后找到差異蛋白點37個，表達上調的有23個，表達下調

13、的有14個。對這些差異蛋白點利用MALDI-TOF/TOF質譜儀進行蛋白質鑒定，共鑒定出28種蛋白質。對鑒定的28種蛋白質進行檢索，發(fā)現有19種蛋白為確證的磷酸化蛋白質。
　　通過對鑒定的蛋白質作亞細胞定位預測分析，我們發(fā)現有2個蛋白定位于細胞骨架;既可定位于細胞質內，又可定位于其它多個亞細胞結構的有20個;在其它亞細胞結構定位，但是沒有定位于細胞質的有6個。通過定位預測分析后，我們又對蛋白質進行功能分析，并結合相關文獻，發(fā)現這些

14、差異蛋白功能涉及分子伴侶、氧化還原酶、抗凋亡蛋白、細胞周期蛋白、細胞骨架蛋白等。此外，采用String數據庫和軟件對所鑒定蛋白質的相互作用進行分析，發(fā)現其中8種蛋白具有直接或間接的相互作用，它們構成一張相互作用網絡圖。
　　通過研究，我們得出以下幾點結論:
　　1.差速離心法結合密度梯度離心法是提取肝臟細胞細胞質的有效方法。
　　2.應用金屬磷酸鹽親和層析樹脂成功富集了細胞質磷酸化蛋白并利用2D DIGE分離技術分離了

15、正常和內毒素休克BALB/c小鼠(LPS1h)的肝細胞細胞質磷酸化蛋白，并建立了相應的差異蛋白圖譜。通過相應的軟件分析，得到了37個具有統計學意義的差異蛋白點。
　　3.對37個差異蛋白點進行質譜鑒定，去除角蛋白污染和重復蛋白后，共鑒定出28種蛋白，其中19種蛋白是確證的磷酸化蛋白質。
　　4.對28種差異蛋白進行亞細胞定位分析發(fā)現，2個蛋白定位于細胞骨架;既可定位于細胞質內，又可定位于其它多個亞細胞結構的有20個;在其它亞