水通道蛋白在復(fù)合物48-80所致大鼠喉水腫中的作用研究.pdf

1、前言
　　 喉是呼吸道的門戶,其聲門下區(qū)是各種喉損傷因素,如感染、插管、過敏反應(yīng)等最常累及的部位,由于其組織疏松易于水腫,而且外包環(huán)狀軟骨,使其空間相對固定,極易引起喉梗阻,如果不及時而正確的處理,會危及患者生命,因而,很多學(xué)者致力于喉水腫的研究,但迄今為止,其發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在分子機制尚未明確。近年研究發(fā)現(xiàn)了組織細胞中水通道蛋白(aquaporin,AQP)在控制水轉(zhuǎn)運中起重要作用。
　　 AQP屬于小分子(單體分子量約3

2、0kDa)、完整膜蛋白家族,主要表達于各類型細胞胞膜上,促進水順滲透梯度的跨膜轉(zhuǎn)運。研究表明AQP不但參與很多生理過程,而且與腦水腫、肺水腫、胃粘膜水腫、分泌性中耳炎等涉及水轉(zhuǎn)運異常的病理過程有關(guān)。業(yè)已證明在喉部主要有AQP1、AQP3、AQP4、AQP5表達,它們可能參與喉生理、甚至病理過程。AQP是否與喉聲門下區(qū)水腫的病理過程有關(guān),目前尚未查到文獻依據(jù)。
　　 研究還發(fā)現(xiàn)AQP的表達與腎臟、肺臟、皮膚等發(fā)育和功能成熟密切相關(guān)

3、,喉水腫尤其多見于小兒,除小兒喉腔窄小、組織疏松等解剖因素外,是否與小兒和成人AQP表達的差異有關(guān)尚不清楚。
　　 目前,臨床用于改善喉水腫的藥物主要是地塞米松,研究表明它可以調(diào)節(jié)AQP的表達來改善腦水腫和肺水腫。高滲鹽溶液(Hypertonicsaline,HS)作為一個滲透治療制劑,可以在血管內(nèi)外建立高滲梯度,促進水從血管周組織進入血液循環(huán),因此被廣泛用于腦水腫的治療。HS改善腦水腫的作用與AQP的調(diào)節(jié)密切相關(guān),但地塞米松改

4、善炎性喉水腫的作用是否與AQP的調(diào)節(jié)有關(guān),HS對喉水腫的作用及其機制的研究我們目前尚未查見文獻報道。
　　 引起喉水腫最常見的原因是喉炎,研究表明喉部炎癥水腫過程與廣泛分布于粘膜上皮和粘膜下結(jié)締組織中的肥大細胞的脫顆粒作用密切相關(guān)。Lidegran等證明肥大細胞脫顆粒劑復(fù)合物48/80可引起大鼠喉聲門下區(qū)水腫,但參與的分子機制尚不明確。
　　 本實驗的目的就是應(yīng)用上述模型來探討AQP在炎性喉水腫中的作用,從而為喉水腫的治

5、療提供新的方向。為此我們設(shè)計三個實驗,首先,觀察AQP1、AQP3、AQP4、AQP5在大鼠喉聲門下區(qū)生后不同發(fā)育時期的表達及在成年大鼠喉聲門下區(qū)的分布,為進一步AQP的功能研究打下基礎(chǔ);第二,觀察AQP在復(fù)合物48/80所致大鼠喉水腫模型中的表達變化,以探討AQP在喉水腫進展中的作用;最后,觀察地塞米松和HS對上述喉水腫模型的作用及AQP的改變,探討是否喉水腫的改善與AQP的調(diào)節(jié)有關(guān)。
　　 方法
　　 1、應(yīng)用免疫印

6、跡方法半定量檢測生后1、7、14、21、56天的正常Sprague-Dawley(SD)大鼠喉聲門下區(qū)AQP1、AQP3、AQP4、AQP5蛋白表達變化,應(yīng)用免疫組化方法確定各AQP在成年大鼠喉聲門下區(qū)的分布位置。
　　 2、選取成年健康雄性SD大鼠,隨機分為4組,即對照組、水腫模型10min組、水腫模型30min組、水腫模型1h組。水腫模型組大鼠經(jīng)尾靜脈注射復(fù)合物48/80,對照組注射等量無菌水。分別測量新鮮喉聲門下區(qū)組織(濕

7、重,W)和烘干后的喉組織(干重,D)的重量,計算干濕重比值(W-D/W×100%)來確定喉水含量,行HE染色鏡下觀察喉水腫情況并評分,應(yīng)用免疫組化和免疫印跡技術(shù)檢測各AQP蛋白表達的變化。
　　 3、選取成年健康雄性SD大鼠,隨機分為4組,即對照組、水腫模型組、地塞米松干預(yù)組、10%高滲鹽溶液干預(yù)組。水腫模型制備同上,地塞米松干預(yù)組于注射復(fù)合物48/80后立即靜脈注射地塞米松注射液(3mg/kg);高滲鹽干預(yù)組于注射復(fù)合物后立即

8、靜脈滴注10%高滲鹽溶液(10%HS,0.3ml/h)。同上法測量并計算喉水含量,HE染色觀察并評分,檢測AQP蛋白表達變化。
　　 結(jié)果
　　 1、免疫印跡結(jié)果顯示AQP1、AQP3、AQP4、AQP5于生后大鼠喉聲門下區(qū)均出現(xiàn)表達,隨著生后時間的延長各AQP蛋白表達量均逐漸增加。免疫組化結(jié)果顯示AQP1主要表達于大鼠喉聲門下區(qū)血管內(nèi)皮細胞,AQP3、AQP4主要表達于喉粘膜上皮細胞,AQP5主要表達于粘膜下腺體上皮細

9、胞。
　　 2、水腫模型10min和30min組大鼠喉部水含量明顯增加,與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),之后逐漸減少,水腫模型lh組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HE染色可見水腫模型10min和30min組喉聲門下區(qū)組織疏松水腫,大量炎性細胞浸潤,損傷分數(shù)與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),水腫模型1h組組織水腫減輕,水腫評分與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但仍有大量炎細胞浸潤,炎細胞浸潤評分與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)

10、差異(P＜0.05)。免疫組化和免疫印跡顯示水腫模型10min和30min組AQP1和AQP5表達明顯下降,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),而AQP3和AQP4的表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,水腫模型1h組AQP1表達升高,與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異,AQP5的表達仍低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、高滲鹽干預(yù)組喉部水含量顯著小于水腫模型組(P＜0.05),地塞米松干預(yù)組喉水含量與水腫模型

11、組比較無顯著性差異,HE染色和損傷評分顯示HS顯著減輕了喉水腫,與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),但沒有明顯減少炎細胞浸潤;地塞米松沒有明顯減輕此模型的喉水腫,但顯著減少了組織炎細胞浸潤,與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。免疫組化和免疫印跡顯示高滲鹽干預(yù)組AQP1的表達與水腫模型組比較顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),而AQP5的表達與水腫模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異;地塞米松干預(yù)組AQP5的表達與水腫模型組比較顯著

12、提高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),而AQP1的表達與水腫模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)論
　　 1、AQP1、AQP3、AQP4和AQP5隨著大鼠喉聲門下區(qū)的生后發(fā)育表達逐漸增強,提示AQP與大鼠生后喉發(fā)育成熟有關(guān);
　　 2、AQP1、AQP3、AQP4、AQP5的表達出現(xiàn)在大鼠喉聲門下區(qū)不同的位置,說明它們可能在大鼠喉聲門下區(qū)的生理和病理過程中起到不同的作用;
　　 3、AQP1與肥大細胞脫