組蛋白修飾和SWI-SNF復(fù)合物在BMSCs向SMCs分化中作用的研究.pdf

1、目的：
　　在體外，成體干細(xì)胞(adult stem cells，ASCs)通過細(xì)胞因子、基因修飾、機(jī)械牽拉等方法，能夠被誘導(dǎo)分化為平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells，SMCs)。非直接接觸共培養(yǎng)是誘導(dǎo)分化途徑之一，更為簡(jiǎn)單易行。然而，迄今為止關(guān)于ASCs是否能夠通過這種方式被誘導(dǎo)分化為SMCs尚無定論。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)因體外易獲取、

2、無倫理學(xué)爭(zhēng)議以及免疫源性小等特點(diǎn)，被認(rèn)為是組織工程理想的種子細(xì)胞。因此，通過Transwell小室建立大鼠BMSCs和膀胱SMCs的非接觸共培養(yǎng)模型，鑒定非接觸共培養(yǎng)能否誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化，為體外干細(xì)胞分化提供新的誘導(dǎo)途徑，并為下一步的研究建立細(xì)胞模型。
　　表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控的另一種機(jī)制是ATP依賴的染色質(zhì)重塑復(fù)合物。SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物通過ATP水解釋放能量，松解致密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，使TF更易接近并結(jié)合DNA。BR

3、G1/BRM(Brahma-related Gene 1/Brahma，BRG 1/BRM)是SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物的核心亞單位。有研究發(fā)現(xiàn)，BRG1/BRM和SMCs標(biāo)志基因表達(dá)有關(guān)，提示在BMSCs向SMCs分化過程中，BRG1/BRM可能參與其中。迄今為止，BRG1/BRM調(diào)控SMCs標(biāo)志基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制尚不明確。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)組蛋白特定位點(diǎn)的乙?；龠M(jìn)SMCs標(biāo)志基因的表達(dá)。因此，我們提出假設(shè):SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)

4、合物可能聯(lián)合組蛋白特定位點(diǎn)的乙?；揎?，共同調(diào)控SMCs相關(guān)基因的表達(dá)。通過揭示BRG1/BRM在BMSCs向SMCs的分化中的作用，為表觀遺傳調(diào)控干細(xì)胞分化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.非直接接觸共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化
　　頸椎脫臼法處死3-4周齡雌性SD大鼠，無菌分離雙側(cè)的股骨和脛骨，通過貼壁培養(yǎng)方法獲得BMSCs;同時(shí)，逐層分離下腹部皮膚，膀胱頸處離斷后通過膠原酶消化法獲得SMCs。BM

5、SCs用含10％ FBS（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM-F12培養(yǎng)劑培養(yǎng)，SMCs用含10％ FBS的DMEM-HG培養(yǎng)劑培養(yǎng)，P3-4細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。為了鑒定BMSCs的干性，我們用流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)鑒定BMSCs表面CD29、CD31、CD45、CD34的表達(dá)情況。為了鑒定SMCs，我們用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)(confocal laser scanning micros

6、cope，CLSM)鑒定SMCs的α-SMC、Calponin和SM-MHC蛋白表達(dá)情況。為了建立BMSCs向SMCs非接觸共培養(yǎng)模型，我們將2×105 SMCs接種在Transwell小室（直徑小于3μm）的外室面，待其貼壁后將同等數(shù)量的BMSCs接種在小室的內(nèi)室面，懸在六孔板中，將BMSCs和SMCs培養(yǎng)基按照1∶1比例混合后培養(yǎng)，不同時(shí)間點(diǎn)用細(xì)胞刮收集細(xì)胞。定量PCR(quantity reverse transcription-

7、polymerase chainreaction，q-PCR)技術(shù)和WB技術(shù)(western blot，WB)測(cè)定α-SMC、Calponin和SM-MHC在共培養(yǎng)的BMSCs的表達(dá)情況。
　　2.組蛋白修飾在丁酸鈉促BMSCs向SMCs分化中的調(diào)控機(jī)制
　　用定量PCR技術(shù)測(cè)定不同濃度NaB干預(yù)BMSCs48h后α-SMC、Calponin和SM-MHC的mRNA表達(dá)情況;CLSM技術(shù)測(cè)定上述基因的蛋白表達(dá)。為了建立NaB

8、聯(lián)合共培養(yǎng)促進(jìn)BMSCs向SMCs分化的方法，我們先用不同濃度NaB干預(yù)BMSCs48h，然后再與SMCs在Transwell小室上共培養(yǎng)，最后在不同的時(shí)間點(diǎn)用細(xì)胞刮收獲細(xì)胞。定量PCR方法測(cè)定α-SMC、Calponin和SM-MHC基因的表達(dá)情況，WB和CLSM測(cè)定上述基因的蛋白表達(dá)情況。
　　3.SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物在BMSCs向SMCs分化中的調(diào)控機(jī)制
　　我們首先通過英俊生物公司設(shè)計(jì)并合成靶向干擾BRG1

9、和BRM基因編碼區(qū)的小分子干擾RNA片段（small interfering RNA，siRNA）三條，按照Lipofectamine2000說明書操作步驟轉(zhuǎn)染BMSCs，定量PCR技術(shù)測(cè)定BRG1和BRM基因表達(dá)情況，最終篩選出最佳干擾片段。為了明確BRG1和BRM對(duì)BMSCs向SMCs分化的影響，我們用定量PCR和CLSM技術(shù)，對(duì)比siBRG1和siBRM轉(zhuǎn)染共培養(yǎng)的BMSCs前后，α-SMC和SM-MHC基因的表達(dá)情況。為了闡明B

10、RM是否聯(lián)合組蛋白特定位點(diǎn)乙?；揎椆餐{(diào)控SMCs標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄，我們首先用CLSM技術(shù)對(duì)比siBRM轉(zhuǎn)染前后共培養(yǎng)的BMSCs的H3K9ace、H3ace和H4ace蛋白表達(dá)的情況，同時(shí)用ChIP-qPCR技術(shù)對(duì)比H3K9ace、H3ace和H4ace在α-SMC和SM-MHC基因啟動(dòng)子區(qū)的富集量變化。為了明確BRM聯(lián)合H3K9ace、H3ace和H4ace促進(jìn)共培養(yǎng)的BMSCs向SMCs分化是否通過SRF轉(zhuǎn)錄因子實(shí)現(xiàn)，我們用CLS

11、M技術(shù)和ChIP-qPCR技術(shù)對(duì)比siBRM干擾前后共培養(yǎng)的BMSCs的SRF在SMCs標(biāo)志基因啟動(dòng)子區(qū)富集量的變化。
　　結(jié)果：
　　1.非直接接觸共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化
　　鏡下，原代BMSCs呈梭形，散在針尖樣排列，貼壁生長(zhǎng)，形成集落;原代SMCs呈多邊形，傳代后胞內(nèi)有較多空泡。FCM結(jié)果顯示BMSCs穩(wěn)定表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志CD29，不表達(dá)CD34、CD45和CD31。CLSM結(jié)果顯示SMCs高表

12、達(dá)α-SMA、Calponin和SM-MHC蛋白。定量PCR結(jié)果顯示共培養(yǎng)72h后，BMSCs的α-SMA、Calponin和SM-MHC基因表達(dá)水平明顯升高。提示體外非接觸共培養(yǎng)能夠有效誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化。
　　2.組蛋白修飾在丁酸鈉促BMSCs向SMCs分化中的調(diào)控機(jī)制
　　1、為了測(cè)定NaB對(duì)BMSCs增殖和向SMCs分化的影響，我們?cè)贐MSCs培養(yǎng)基中加入不同濃度NaB進(jìn)行干預(yù)，CCK8結(jié)果顯示1.0mmo

13、l/L NaB干預(yù)BMSCs48h后能夠?qū)ζ湓鲋钞a(chǎn)生明顯的抑制作用;定量PCR結(jié)果提示1.0mmol/L NaB干預(yù)48h后能夠顯著提高BMSCs的α-SMA、Calponin和SM-MHC基因的表達(dá)水平。提示NaB能夠誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化。
　　2、為了建立NaB聯(lián)合共培養(yǎng)促進(jìn)BMSCs向SMCs分化的方法，我們分別用不同濃度NaB干預(yù)BMSCs，然后與SMCs共培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞。定量PCR和WB結(jié)果顯示1.0

14、mmol/L NaB顯著提高了共培養(yǎng)的BMSCs的α-SMA、Calponin和SM-MHC表達(dá)水平，另外NaB干預(yù)的共培養(yǎng)，SMCs標(biāo)志基因在共培養(yǎng)的第二天可達(dá)高峰。CLSM結(jié)果證實(shí)1.0mmol/L NaB明顯提高了共培養(yǎng)后的BMSCs的SMCs相關(guān)蛋白的表達(dá)。這部分結(jié)果說明1.0mmol/L NaB聯(lián)合共培養(yǎng)能夠在共培養(yǎng)的第二天提高BMSCs向SMCs的分化效率。
　　3.SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物在BMSCs向SMCs

15、分化中的調(diào)控機(jī)制
　　1、為了測(cè)定BRG1/BRM對(duì)共培養(yǎng)的BMSCs向SMCs分化的影響，我們用定量PCR技術(shù)測(cè)定siBRG1和siBRM轉(zhuǎn)染共培養(yǎng)的BMSCs前后對(duì)α-SMA和SM-MHC基因的影響。結(jié)果顯示siBRM轉(zhuǎn)染后α-SMA和SM-MHC基因表達(dá)水平顯著下降;而siBRG1基因干擾對(duì)其表達(dá)沒有明顯影響。CLSM結(jié)果顯示BRM基因抑制后，共培養(yǎng)的BMSCs的α-SMA和SM-MHC蛋白表達(dá)明顯降低。說明在BMSCs向S

16、MCs分化過程中，BRM而不是BRG1促進(jìn)SMCs標(biāo)志基因的表達(dá)。
　　2、為了測(cè)定BRM促進(jìn)SMCs標(biāo)志基因的表達(dá)是否通過SRF和Myocardin實(shí)現(xiàn)，我們用CLSM對(duì)比BRM抑制前后共培養(yǎng)的BMSCs的SRF和Myocardin表達(dá)變化，結(jié)果顯示BRM抑制后SRF和Myocardin表達(dá)降低。為了測(cè)定SRF表達(dá)降低和SMCs標(biāo)志基因的關(guān)系，我們用ChIP-qPCR對(duì)比BRM干擾前后共培養(yǎng)的BMSCs的SMCs標(biāo)志基因啟動(dòng)子區(qū)

17、SRF的富集量變化，結(jié)果顯示BRM抑制后SRF在α-SMA和SM-MHC基因的富集量顯著降低。說明BRM可能通過SRF促進(jìn)SMCs標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄。
　　結(jié)論：
　　通過非直接接觸共培養(yǎng)模型誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化。通過NaB提高了共培養(yǎng)的BMSCs向SMCs分化的效率，同時(shí)增強(qiáng)了分化后細(xì)胞的收縮功能。深入揭示了其中的分子調(diào)控機(jī)制:NaB可能通過降低HDAC2的表達(dá)及其在SMCs標(biāo)志基因啟動(dòng)子區(qū)的富集，從而提高了H3K9a