PRC17相互作用蛋白的篩選和初步鑒定.pdf

1、目的： PRC17是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的癌基因,在多種腫瘤組織和細(xì)胞株中高表達(dá)。尋找和初步鑒定PRC17癌蛋白可能的相互作用蛋白,將有助于闡明PRC17的功能和其導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制,為人類腫瘤的早期診斷和防治提供新線索。 方法： 為尋找PRC17癌蛋白可能的相互作用蛋白,以pGEX-6P-1為載體,構(gòu)建了GST-PRC17融合蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒PRC17/pGEX;將pGEX-6P-1和PRC17/pGEX質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)

2、導(dǎo)入大腸桿菌BL21并經(jīng)IPTG大量誘導(dǎo)表達(dá)GST和GST-PRC17蛋白后,用Glutathione Sepharose 4B對(duì)GST和GST-PRC17蛋白分別進(jìn)行了親和純化。 以純化的GST蛋白為對(duì)照,將GST-PRC17融合蛋白與HeLa細(xì)胞裂解物進(jìn)行GSTPull-down分析；沉淀的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色后,將PRC17可能的結(jié)合蛋白條帶進(jìn)行肽指紋(PMF)圖和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)分析；將獲得的數(shù)

3、據(jù)輸入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索,以獲得與數(shù)據(jù)匹配的蛋白信息,初步篩選出PRC17蛋白的可能相互作用蛋白。 為初步鑒定篩選出的β微管蛋白與PRC17之間的相互作用,以GST蛋白為對(duì)照,用GST-PRC17融合蛋白與HeLa細(xì)胞裂解物進(jìn)行GSTpull-dwon分析；用抗β微管蛋白抗體進(jìn)行Western Blot分析以檢測(cè)沉淀中的β微管蛋白。 為研究PRC17癌蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布,以pEGFP為載體,構(gòu)建了EGFP-PRC17綠

4、色熒光蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒PRC17/pEGFP;為研究β微管蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布,用RT-PCR方法,從制備的HeLa細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增了β微管蛋白2C的cDNA完整開放讀碼框架(openreading frame,ORF),將之插入pDsRed-Monomer載體后,得到DsRed-β微管蛋白2C(紅色熒光蛋白)真核表達(dá)質(zhì)粒TubB2C/pDsRed。將EGFP-PRC17/pEGFP和DsRed-TubB2C/pDsRed質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染He

5、La細(xì)胞后,在熒光顯微鏡下觀察PRC17和β微管蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。 結(jié)果： 構(gòu)建的GST-PRC17融合蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒PRC17/pGEX經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切后出現(xiàn)1662 bp特征性片段,PRC17 cDNA序列經(jīng)測(cè)序證實(shí)無(wú)誤。大腸桿菌BL21在分別用PRC17/pGEX和pGEX-6P-1轉(zhuǎn)化后,由IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白分子量均符合預(yù)期,為89.2 kDa(GST-PRC17融合蛋白)和28.4 kD

6、a(GST蛋白),而未轉(zhuǎn)入任何質(zhì)粒的BL21和轉(zhuǎn)入pGEX-6P-1或GST-PRC17/pGEX質(zhì)粒而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21陰性對(duì)照,則在相應(yīng)分子量處僅見非常弱的非特異性蛋白條帶。Western Blot分析結(jié)果顯示抗GST抗體可特異性識(shí)別GST-PRC17蛋白,但不能識(shí)別陰性對(duì)照的非特異性蛋白。在非變性條件下(1％NP40裂解液和超聲破碎儀裂解細(xì)菌菌體),GST-PRC17和GST蛋白被用Glutathione Sepharos

7、e 4B進(jìn)行了初步親和純化。用純化的GST和GST-PRC17蛋白與HeLa細(xì)胞裂解物進(jìn)行GST Pull-down分析,發(fā)現(xiàn)多條PRC17的可能結(jié)合條帶,其中以大約23 kDa,55 kDa和100 kDa分子量處的三條蛋白條帶較明顯,而陰性對(duì)照GST蛋白和未與HeLa細(xì)胞裂解物進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)的GST-PRC17蛋白的相應(yīng)分子量處無(wú)明顯蛋白條帶或蛋白條帶非常弱。經(jīng)肽指紋圖(PMF)和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)檢測(cè)和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,兩條蛋白

8、條帶分別匹配β微管蛋白和TBC1D3蛋白(即PRC17自身),而另一蛋白條帶無(wú)高可信度的匹配結(jié)果。 為初步鑒定PRC17與β微管蛋白之間的相互作用,以GST蛋白為對(duì)照,用GST-PRC17融合蛋白與HeLa細(xì)胞裂解物進(jìn)行GST pull-dwon實(shí)驗(yàn)后,用抗β微管蛋白抗體進(jìn)行Western Blot分析,顯示PRC17與β微管蛋白結(jié)合,而陰性對(duì)照GST蛋白并不結(jié)合β微管蛋白,證實(shí)PRC17蛋白可特異性結(jié)合β微管蛋白。 將

9、構(gòu)建并鑒定的EGFP-PRC17(綠色熒光蛋白)和DsRed-β微管蛋白(紅色熒光蛋白)真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后,在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)PRC17分布在細(xì)胞漿內(nèi)及細(xì)胞質(zhì)膜上,細(xì)胞內(nèi)的PRC17主要呈小泡樣結(jié)構(gòu)廣泛分布；而β微管蛋白在細(xì)胞內(nèi)也呈廣泛分布。PRC17和β微管蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布有待用激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行深入研究。 結(jié)論： 1.PRC17可能存在多種結(jié)合蛋白； 2.β微管蛋白可能是PRC17的結(jié)合