兩個(gè)棉花14-3-3蛋白相互作用蛋白質(zhì)的篩選與鑒定.pdf

1、在以前的研究中，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)棉花14-3-3蛋白質(zhì)在野生型和棉花纖維發(fā)育突變體中差異表達(dá)。其中一個(gè)(EST為gi|78344446)在無(wú)絮棉突變體-3 DPA胚珠中上調(diào)表達(dá)，另一個(gè)(EST為gi|78324056)在徐州142陸地棉0 DPA胚珠中表達(dá)卻在突變體0 DPA胚珠中不表達(dá)。表明14-3-3蛋白可能在纖維發(fā)育過(guò)程中起到調(diào)控作用。14-3-3蛋白是一類廣泛存在于真核生物中高度保守的調(diào)控蛋白，主要通過(guò)與其它蛋白發(fā)生相互作用而發(fā)揮調(diào)控

2、功能，因此探索14-3-3蛋白的功能應(yīng)從研究與14-3-3蛋白互作的蛋白入手。
　　 本研究首先克隆了兩個(gè)差異表達(dá)14-3-3蛋白質(zhì)的編碼基因全長(zhǎng)，然后克隆到pET30原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后用Ni-NTA樹脂純化出帶有六聯(lián)組氨酸標(biāo)簽的14-3-3蛋白。從徐州142、徐州142無(wú)絮突變體、TM-1和李氏纖維有限伸長(zhǎng)突變體的-3、-1、0 DPA胚珠和3、6 DPA纖維中提取總蛋白并等

3、量混合。以該混合蛋白為獵物蛋白質(zhì)源，以兩個(gè)14-3-3蛋白質(zhì)為誘餌，分別進(jìn)行pull-down試驗(yàn)，獲得棉花胚珠與纖維總蛋白中與14-3-3蛋白互作的蛋白，雙向電泳分離后進(jìn)行質(zhì)譜分析，鑒定14-3-3相互作用蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步研究14-3-3蛋白在纖維發(fā)育中的作用打下了基礎(chǔ)。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1、根據(jù)EST序列（gi|78344446和gi|78324056），利用RACE技術(shù)，從陸地棉中克隆2個(gè)14-3-

4、3蛋白編碼基因全長(zhǎng)，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)是新的棉花14-3-3蛋白家族基因，命名為Gh14-3-3-like protein2（GenBank登錄號(hào):JF320796），另一個(gè)序列與Gh14-3-3b（GenBank登錄號(hào):EU189221）僅相差三個(gè)氨基酸，可能是同一個(gè)蛋白。
　　 2、將兩個(gè)14-3-3蛋白編碼基因全長(zhǎng)加上六聯(lián)組氨酸標(biāo)簽并克隆至pET30原核表達(dá)載體上，IPTG誘導(dǎo)下，兩個(gè)蛋白質(zhì)均超量表達(dá)，SDS-PAGE電

5、泳檢測(cè)其分子量大約為30kD，與理論分子量一致。使用Ni-NTA鎳柱純化了這兩個(gè)帶6×His標(biāo)簽的14-3-3蛋白。
　　 3、分別以這兩個(gè)蛋白質(zhì)為誘餌，采用pull-down方法從-3、-1、0 DPA胚珠，3、6 DPA纖維提取的混合蛋白質(zhì)中分離14-3-3的相互作用蛋白質(zhì)。對(duì)分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳，MALDI-TOF-TOF串聯(lián)質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)了23個(gè)與Gh14-3-3-likeprotein2相互作用的蛋白，其中